家蝇金属硫蛋白的cDNA克隆与序列测定-动物学专业论文.docx

摘要本文在前人对家蝇MT研究的基{if||，b谶 摘要 本文在前人对家蝇MT研究的基{if||，b谶 步探索体外扩增家螂Mi1 eDNA站因。试 验中慕疆2壤％∥对象蟋初孵钧斑诱导辐，j、瓣，使其锌海金璃蘸蛋囊穗凇表达达爱禽蜂， 在液氨中将其研磨成粉末后采用异硫氰酸胍法提取总RNA，谢用Promega公司提供冉勺小 鐾分离mRNA试裁盒缝健mRNA。|苎欺mRNA为摸板。搬据已发表的暴蝇以及篡它生物的 孵鏊因的保守序列，通过计簿机同源检索i={l：较。设计两个扩增日i物，命名为；：jI物l平¨日1 物2，gl物I的序列是；5’CAA GTG AAT CAT CTC AGT GC 3’，Bl甥2敬垮列是：5’ 憾T矗GA GAG ACA AGA TGC AG 3’。群利角反转录PCR技术(One Step RNA斛一PcR Kit) 直接一次性依次合成cDNA第～链、cDNA第二链、DNA扩增。用回收试裁鑫鲻收拶‘增产 耱，褥将冀克隧刭p莉18-1’藏粒载体}二，在转化平嘏．t经过甄苄鬻释豢抗後敝“一嚣补 初步筛选，随机挑取4个自色茼落，逃一‘步利用转化载体oMDl8-T。l二插入心段明端的鼹 争艰制幢蠹翻酶位点勘龋I和Hind{{{进行双酶韬蕊定，将获褥静阳性竟臻子荐进行 PCR撩定。最厝将经_；建鉴定筛选的两个阳性觅隆子进行序列测定与分析。结聚显示；扩 增熬eDNA翳‘段长度趣289bp，其巾禽蠢一争编褥45令氨基酸黪西藏瀚读躯，瓣读藜新编 码的氨基酸中含有10个半胱餐酸，且猩序列中均排列成Cys—X—Cys，其中x为8er、Vat、 HiS或Lys。这些特髹澄臻萝’壤靛鏊嚣片段为家蟪瓣鏊毽垮列麓一郝努。筵熬嚣痔到片 段与果蝇MTn基因序列的同源性达到85．o％，扩增的基因序列中含柯三个内切酶位点 鞣“、I溉剥{秘融fii，运‘点瞧和聚拣MTn祭蹶‘略}榭秘。遮醢嘲科舔阂技蠢豫守住；。 推导的氨基酸序列组成分析结果显示：此MT分子量为5456．8 Da。分子中半胱氨酸台屣 最鑫，这餮22，2镌，其次隽赖氨酸(8。潞)和熬蘸酸(7．?鞋)。痔建辛还含畜少量麓耩褥 族氨羲酸，如黼氨酸(3．3％)，苯丙氨酸(3．0％)和组氨酸(2．8％)，这一点和牡蛎MT 榴弘，丽不爨予粜竭帮磷巍动物MT￡不含有芳香获懿基酸和缀氦酸。洼l扩增片段船编 码序列所推导的家蛹黼与其它生物黼比较显示：家蜷MT氨基酸序列姆果蝇(Drosophila melaoogaster)iktTn爨基酸序列的冠源瞧最醚，达裂65螺；与帮努无糟椎动物淑氮基酸 序列的同源髓在35％-41％韵范豳内；与部分植物孵氨纂酸序梦0的同源性比较缩栗为：同 源牲磺商的为融子植物墨角藻(Ptwtts yesicutosus)(51％)，两最低的为秘予楼物鼠巧 芬(Arabidopsis the?ianal)(3确)；与晡鞲，动物绿猴湃一{}的丽源豫运剥4{％，唏八 类州一Il的同源性为3嚣％。 关键调l蒙蝇，金满滚蛋囱蒸嚣，eDNA竟澈，痔捌溯定 Clonging Clonging and Sequencing of MT cDNA Gent in Housefly Larvae (Musca domesticu vicina Macquart) Abstract Basing on the research of housefly MT by the Insect Resource Institute of Hum Zhong Agricul tural Uni versi ty，We went further to explore cloni ng cDNA sequence of housefly MT gene．In the experiment，the first instar housefly larvae’metallothionein mRNA expressing reach maximun after induced by Cd(2mM) for 48 hours，then total RNA was extracted With guanidinium i sothiocyanate，and mRNA was i solated by the PolyATtract mRNA Isolation Systems surplled by Promega company．The isolated mRNA was used as template．Two specific primers were designed and synthesized based on the conservative sequence contrasted