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脉冲场凝胶电泳(PFGE)实验原理、操作步骤和注意事项 大分子DNA(一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb)在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”)，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb?之间的DNA?片段。 【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb)在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”)，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE)。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE)设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。FIGE也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb。【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1)TEN 缓冲液(0.1mol/L HYPERLINK /yp/product-list-702.html \t _blank Tris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/L HYPERLINK /yp/product-list-700.html \t _blank EDTA)。2)Seaplaque HYPERLINK /yp/product-list-642.html \t _blank 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%)。3)EC 缓冲液(6mol/L HYPERLINK /yp/product-list-702.html \t _blank Tris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5% Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate)；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)。（生物秀实验频道 ）4)ESP 缓冲液(0.5mol/L HYPERLINK /yp/product-list-700.html \t _blank EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL HYPERLINK /yp/product-list-470.html \t _blank 蛋白酶K)。5)溶葡萄球菌素(5mg/mL)。6)RNase(10mg/mL)。7) 胶模(由常规 HYPERLINK /yp/product-list-642.html \t _blank 琼脂糖凝胶制得或购买成品)。8)苯甲基横酰氟(PMSF)(17.4mg/mL 于乙醇中)。9)0.5μg/mL 溴化乙锭2.分离、纯化大的DNA 片段所需材料1)紫外递质。2)10mg/mL tRNA。3)5mol/L NaCl。4)苯酚/氯仿。5)3mol/L NaAc，pH5.2。6)95%乙醇。易生物仪器库： HYPERLINK /yp/product-list-42.html \t _blank /yp/product-list-42.html易生物试剂库： HYPERLINK /yp/product-list-43.html \t _blank /yp/product-list-43.html3.设备1)TBE 缓冲液。2)Seakem HGT 琼脂糖。3)Wide Mini-Sub Cell 凝胶电泳设备。4)变速泵或蠕动泵 (Bio-Red Laboratory)。5)IBI FIJI 600 HV 程序性开关设备。6)缓冲液冷却循环器 (Fotodyne ， New Britain ，WI) 或Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory)。【实验步骤】1.脉冲电场凝胶电泳的DNA 样品的制备为避免大分子DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌(StapHylococcus aureus)作为例子。1)取100mL 对数生长期金黄色葡萄球