DNA测序技术指导原则.PDF

2020 年版第一次征求意见稿 DNA 测序技术指导原则 本指导原则用于指导药品生产和检验过程中DNA 序列的测定，可用于鉴定 动植物类药材、动物源性原材料与辅料、微生物、生物制品生产检定用菌毒株、 动物细胞基质等。 为规范DNA 测序技术中涉及的模板制备、测序反应、产物纯化、测序和结 果分析等，特制定本指导原则。 一、定义及要求 DNA 测序技术系指分析DNA 碱基构成和碱基顺序的技术，即用于确定DNA 片段中腺嘌呤（A ）、胸腺嘧啶（T ）、鸟嘌呤（G ）、胞嘧啶（C ）的构成和排列方 式。一般采用双脱氧链终止法进行DNA 测序。其原理是利用2,3-双脱氧核苷三 磷酸（2,3-ddNTP ）作为链终止试剂，通过DNA 聚合酶催化和引物延伸产生一 系列长度相差一个碱基的寡核苷酸，进行电泳分离，通过放射自显影或荧光确定 DNA 的序列。除双脱氧链终止法外，DNA 测序技术还包括边合成边测序、单分 子实时测序、纳米孔测序等技术。DNA 测序分析可分为手工测序和自动测序， 当前以自动测序为主流。 DNA 测序实验室应具备分子生物学实验室的基本条件，避免外源污染对 DNA 测序结果的干扰。对生物制品生产检定用菌毒株和动物细胞基质进行DNA 测序时，应符合相应级别的生物安全要求，严格遵守相关法律、法规。操作人员 应具备相应的分子生物学实验技能，并能熟练使用DNA 测序仪。 二、基本内容 （一）测序模板制备 测序模板应为单一来源DNA ，包含质粒DNA 、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR ）扩增产物回收的DNA 等。测序模板制备过程中应防止外源 DNA 污染，避免外部因素对测序模板的破坏和降解。 1. 质粒DNA 的制备 样品经平板培养挑取单克隆菌落接种到含有适当抗生素的培养基中，振荡培 养获得细菌培养物，分离质粒DNA 作为测序模板。 通常采用十二烷基硫酸钠（SDS ）碱裂解法从细菌培养物中分离质粒DNA 。 采用电泳或限制性核酸内切酶消化的方法对所获得的质粒DNA 进行完整性鉴定， 1 / 3 2020 年版第一次征求意见稿 通过260 nm 波长处的吸光度值（A260 ）、260 nm 与280 nm 波长处的吸光度比值 （A260/A280 ）分别检测质粒DNA 的浓度和纯度。 2. PCR 扩增产物DNA 的制备 样品经DNA 提取、PCR 扩增和产物回收后，制备的目的DNA 片段作为测 序反应的模板。 在DNA 提取前，动植物类中药材需采用适宜的方式去除外源污染；动物源 性原材料与辅料的取样应有代表性，固体样品应研磨至细粉，液体样品应充分混 匀；微生物、生物制品生产检定用菌毒株和动物细胞基质需获得纯培养株。在 DNA 提取过程中需针对不同样品采用相应的提取方法，所获得的DNA 应具有 合适的浓度、纯度和完整度。DNA 提取效果依据不同样品类型来确定，通过A260 、 A260/A280 分别检测DNA 的浓度和纯度。 提取的DNA 经PCR 扩增达到指数级倍增，退火温度、最佳循环数可根据检 测要求和检测对象确定。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取目的 条带所在位置的凝胶块，采用PCR 产物凝胶回收试剂盒进行回收。PCR 产物也 可不经琼脂糖凝胶电泳，直接采用PCR 产物纯化试剂盒进行回收。回收的PCR 扩增产物DNA 通过A260 、A260/A280 对其浓度和纯度分别进行检查。 （二）DNA 测序 制备的测序模板经测序反应和产物纯化后获得不同长度的寡核苷酸，进行自 动化测序。 1. 测序反应和产物纯化 测序反应为单链模板的线性扩增，即在测序反应体系中只加入一条测序引物。 反应体系包含缓冲液、DNA 聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs ）、荧光标记 的ddNTPs、测序引物、测序模板和无菌双蒸水。测序引物由测序模板的来源信 息确定。 根据目标序列的长度选择合