实时荧光定量PCR仪.ppt

实时荧光定量PCR仪 一、实时荧光定量PCR的原理 定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 PCR循环 = 双链DNA = 染料 = 荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB 荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便，无需跑胶 罗氏产品介绍以及与同类产品之间的对比 一、LC1.5和LC2.0 LightCycler荧光定量PCR系统 Lightcycler 2.0 结构分析 热力学结构 特点： 1、空气加热 2、毛细管反应体系 优点: 1、升降温速度快（0.05 ℃ -20℃/秒）， 2、体系均一，不存在边缘现象 3、把反应体系缩小到0-20ul，节省试剂成本 实现快速PCR 光学结构 特点： 1、免维护的LED冷光源，寿命长达2万小时以上 2、光学倍增管（Rodenstock ） 3、多达6通道（LC2.0）和3通道（LC1.5）实时检 测 优点： 1、毛细管光学特性将光线散射、衍射降至最低， 避免LED 功率低的问题 2、免维护，带自动检验功能 3、轻易实现内标、内对照及多重PCR LightCycler 结构分析 LightCycler 软件 4.0 更先进的自动定量方法 全新的相对定量软件 全自动熔点曲线分组 全自动熔点温度提示 简化数据和用户管理 PCR领域最聪明的革新 – LightCycler荧光定量PCR系统 超高速 30至40分钟完成PCR过程 实时在线监测 收集每一循环的数据并立即显示于联机电脑上 高灵敏 在一个基因组当量中可检测出单基因拷贝 范围广 可检测10－1010拷贝线性范围，无需稀释样品 开放性 全开放，成为国内外试剂厂家的首选开发平台 六个荧光通道 轻易实现内标、内对照或多重PCR 最小化 定量反应体积降至10－20ul，费用低廉 灵活性 支持水解探针、杂交探针及 SYBR Green I 闭管分析 消除污染风险 Lightcycler 的分析模式 适用于所有的通用探针及染料分析模式： SYBR Green I（荧光染料） TaqMan（水解探针） Molecular beacon（分子信标） Lightcycler上开发独有的分析模式： Hybridization Probe Format（杂交探针） SimpleProbe （单探针） SYBR-Green I 检测模式 SYBR Green I能选择性地与双链DNA结合，在外界光源激发下产生强烈荧光。在PCR过程中， SYBR Green I可与新合成地双链DNA结合，产生地荧光信号强度与双链DNA含量成正比，荧光检测在每一循环的延期后进行。 SYBR Green I与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合产生的干扰可通过融解曲线分析而得到解决。 水解探针（Taqman ）检测模式 同时标记有荧光发光分子和荧光淬灭分子的一条探针在激发光作用下，发光分子所产生的荧光可被淬灭分子吸收，因而检测不到荧光。在PCR延伸时，因Taq酶具有的5，－3，核酸外切酶活性，可降解荧光探针，使荧光发光分子与荧光淬灭分子分开，在外界光源激发下即可发出荧光，荧光强度与PCR扩增产物量有关。 分子信标（Molecular Beacon Probe） 独特的颈环结构，由非特异的颈和特异的环组成，探针的5’端标记荧光分子，3’端 标记一个吸收或淬灭荧光的分子 。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5’端荧光分子与3’端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。