课件：法检测细胞活力.ppt

? 7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 ? 8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 关于细胞的接种(铺板) 细胞过了30代以后就不要用了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。 接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。 细胞密度要根据不同细胞的特点来定。 悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104。  MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。 如何清除上清 直接吸出：加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-160ul即可)。 翻转倒扣法：可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2－3次，比用“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，但前提是细胞贴壁要比较牢。 加入DMSO 在同一批实验中最好不要更换DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul. 加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5－10min, 时间控制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不可信. 加入DMSO溶解后尽快检测。 OD值的测定 至于测定波长的选择是因显色溶液而异的。对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值 。 ? DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而ＳＤＳ做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变。 细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。 谢谢观看 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 可编辑 可编辑 MTT法检测细胞活力 甘肃中医药大学 MTT法目的和意义 检测细胞存活和生长情况 用于评价药物产生的细胞毒作用 原理 四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称MTT 活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。 在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。 活细胞+MTT 琥珀酸脱 氢酶 紫蓝色结晶物 Formazan 贴壁细胞操作步骤 1.??接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔2000-3000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积90 ul。 （边缘孔用PBS或空白培养基填充）。 2.??培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板，大约12h），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药10 ul，一般设5个复孔。 3. 5%CO2，37℃孵育分别孵育24小时后，倒置显微镜下观察。 4. 每孔加入10ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。 6. 每孔加入100ul二甲基亚砜（置摇床上低速振荡10min，使结