课件：蛋白质高效液相色谱技术PPT课件.ppt

THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。 ①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 ②应逐渐改变溶剂的组成 。 ③一般说来色谱柱不能反冲 ，会迅速降低柱效。 ④　选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。 ⑤　需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。 ⑥　经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。 柱的使用和维护注意事项 四 检测系统 要求 灵敏度高 噪音低 适用范围广 重复 性好 UV 检测器 数据处理和计算机控制系统 恒温装置 在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。 采集处理分析数据 控制 仪器 色谱系统优化 流动相的要求 反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用的是甲醇和乙腈。一般情况下甲醇-水已经能够满足多种样品的分离，粘度小，价格低。但推荐乙腈-水做初始实验，与甲醇比，乙腈的溶剂强度高粘度小，并可满足185-205nm处检测的要求。 与检测器相适应 溶剂的纯度 粘度小 沸点低固体残留物少 与色谱系统相适应 流动相的准备 调整PH 根据所分离蛋白质及色谱柱决定 流动相脱气 滤膜过滤 目前实验室主要用的是超声15min左右 溶剂使用前都必须经0.45μm滤膜过滤，以除去杂质微粒。分清有机相滤膜和水相滤膜，对于混合流动相，在混合前过滤 合适的波长 合适的柱温 蛋白样品的性质 HPLC与其他色谱光谱技术的联用 CE MS UF CE CE MS HPLC 高效液相色谱—质谱 蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的重要手段，通过质谱可以实现对蛋白质的自动分离检测。 高效液相色谱—毛细管电泳 当毛细管电泳与HPLC联用时，两者各自优势都得以发挥。HPLC—CE联用技术特别适合细胞或组织中蛋白质的分离 反相高效液相色谱法对血清中胰岛素的测定 色谱柱 流动相 梯度洗脱 其他 C5 柱(100 mm*4.6mm5μm，Ph-enomenex公司，美国 A 相: 10mmol/L Tris缓冲液(pH 8.5) ; B相:乙腈; 流速: 1mL/min B相体积分数变化为:0～15 min, 15%～25.5% ; 15～21 min, 25.5%。 进样量 20μL 柱温 25 ℃ 高效液相色谱目前多用于蛋白质的定量分析，对于大样品的分离纯化成本较高且费时，有待进一步优化其条件或找到适于分离纯化蛋白质的方法。 现状与展望 相信随着新的色谱柱和多种手段的联用，高效液相色谱能够在包括蛋白质在内的大分子物质的研究领域里发挥更大的作用 Thank you THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 * 美国沃特世，安捷伦，日本的岛津公司 * 流动相参与样品与固定相之间的相互作用，使样品在流动相和固定相之间以不同的形式进行分配，根据被分离的样品和固定相的性质合理选择流动相显得至关重要。 常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液 调整弱酸，50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液 调整弱碱 * 为了使蛋白质的检测更加准确方便，人们尝试将HPLC 与其他分析技术联用。目前在蛋白质检测方面比较成功的联用技术主要有 * 这些蛋白质比较复杂，毛细管电泳可以作为HPLC很好的补充，有时单用HPLC无法分离的蛋白质，在毛细管电泳上可以很好的分离。 可编辑 可编辑 高效液相色谱法在蛋白质分离中的应用 陈 檬 S1030624 张双健 S1030621 郭传龙 S1030622 石晨阳 S1030623 汪菊芬 S1030625 高效液相色谱技术特点概述 1 HPLC系统各组分介绍； 2 流动相的要求及准备过程 3 5 4 HPLC色谱技术与其他技术联用 5 HPLC 应用举例 6 现状与展望 6 应用 范围广 高灵 敏度 高效 高压 分析速 度快 HPLC是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。 根据分离机理蛋白质HPLC又可分为 1 2 4 3 高效凝胶过滤色谱(HPSEC) 高效离子交换色谱（HPIEC） 高效亲和色谱（HPAFC） 反向高效液相色谱（RP-HPLC） 高效液相色谱仪 常用的HPLC仪 Waters公司 Agilent公司 岛津公司等 一 进样系统 进样方式 隔膜进样 *