生物物理学2015年第08讲+X射线晶体结构技术.ppt

* 3.5 赤霉素受体的晶体结构 Murase K at al. Nature, 2008, 456:459-463 Structure of GA3-GID1A-DELLA Complex * 晶体学网址 /Xray/101index.html //CrystalEducationSites.html //WhatIsCrystallography.html http://www.ccp4.ac.uk/dist/examples/tutorial/html/ * VIDEO 蛋白质晶体结构的确定 CNRF(法国国立科学研究院拍摄) * Structure Biologists 结构生物学家 * Shi, Yigong 施一公 X-ray protein structures linked with apoptosis 2003, Full Professor, Princeton University 2007, Endowed professor, Princeton University 2008, HHMI Investigator 2009, 清华大学生命科学与医学研究院 * Yan, Ning 颜宁 X-ray membrane protein structures 2004, Ph.D., Princeton University 2007, Post-doc, Princeton University 2009, 清华大学医学院 * The End * 衍射线的强度与晶胞中原子的分布 (原子坐标) 用fj表示原子散射射线的能力,与其所含电子数成正比 结构因子: A,B产生次生电子波,叠加后产生共同电场强度,称为结构因子,它的大小决定于原子种类 F=fAeiΦ1 + fBeiΦ2 Ф=2πΔ/λ 例如NaCl晶体, A原子:Na, B原子:Cl * 原子坐标的确定 1. 晶体: 0.2-0.3 mm3 2. 收集衍射数据(测定晶胞大小,形状, a,b,c, α,β,γ),测定强度I F0 3. 数据处理 4. 计算电子密度分布 5. 解释电子密度分布;测定(xi,yi,zi) * 晶体结构-电子密度分布 根据傅立叶变换的性质, F(s)的逆傅立叶变换为 v为晶胞的体积 根据上式，如果能测定代表晶体衍射波的结构因子F(s)，就能算出代表晶体结构的电子密度函数 ?(r) 根据电子密度的大小，可以推断出原子在空间的分布，亦即分子三维结构 * Conclusion 1. X射线晶体学是利用电子对X射线的散射作用，可以获得晶体中电子密度的分布情况，再从中分析获得原子的位置信息，即生物大分子的晶体结构。 2. 晶体中含有数量巨大的方位相同的分子，X射线对这些分子的衍射叠加在一起就能够产生足以被探测的信号。从这个意义上说，晶体就是一个X射线的信号放大器。 * X-射线晶体结构分析技术 1. 晶体 2. 晶体培养 2.1 蛋白质结晶的条件 2.2 蛋白质结晶的方法 2.3 蛋白质晶体的优化 3. 受体晶体结构研究实例 * 蛋白质的提纯 蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 * 蛋白质的提纯 蛋白质粗制品的获得2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。  * 3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。 使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 蛋白质的提纯 * 样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质。 常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。 蛋白质的提纯 * 2. 晶体培养 用于X射线衍射的晶体条件: 单晶,即同一种物质的单一晶胞有序排列而成 一定形状,一定大小, 0.2~0.3 mm3 蛋白质结晶的条件: 蛋白质分离纯化, 得到电泳纯的蛋白质样品 蛋白质溶液达到过饱和状态,与蛋白质溶解性有关,与pH有关, 与所加盐的离子强度有关 晶体生长: 过饱和速度快, 晶体数量多,不大; 过饱和速度慢,数量少,长得大; 关键是控制过饱和速度,使晶体长得体积较大 * 影响蛋白质结晶的因素 样品