弓形虫瞬时转染中不同启动子介导双报告基因优化.PDF

弓形虫瞬时转染中不同启动子介导的双报告基因优化 * 郝永新，李雪莲，刘 群 ，陈 丹 (中国农业大学动物医学院 北京 100193) E-mail: qunliu@ 摘 要：方 法 针对弓形虫的 GRA1、DHFR和 SAG1启动子，构建了一系列荧光素酶和绿色荧光蛋 白双报告基因载体。瞬时转染弓形虫，运用荧光倒置显微镜和流式细胞术检测荧光蛋白的表达， 用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的活性，定量监测载体转染效率。结 果 串连 YFP 荧光蛋 白和 GFP 荧光蛋白在相同启动子趋动下，前者荧光强度约是后者的 3.9 倍。串联 YFP 报告基因 比 GFP 报告基因敏感性高。串联 DHFR-DHFR 启动子构建的载体比 GRA1-DHFR 串联及 SAG1-DHFR 串联启动子所构建的载体的荧光素酶活性和荧光蛋白表达强度低。定量监测同一载体的转染效 5 7 4 7 率，不论使用哪种启动子，电转 10 到 10 弓形虫可检测到荧光蛋白表达，电转 10 到 10 弓形虫 可检测到荧光素酶的活性。结 论 成功构建了以串连 YFP 和荧光素酶为双报告基因的基于弓形 虫 3个不同启动子（GRA1、DHFR和 SAG1）的瞬时转染载体。荧光素酶报告基因的敏感性高于荧 光蛋白报告基因。以 GRA1和 DHFR为启动子建立的双报告基因系统要比以 SAG1启动子建立的双 报告基因系统，更适宜于基因转染的监测。 关键词：弓形虫；瞬时转染；荧光素酶；荧光蛋白；流式细胞术 中图分类号：S852.72+3 本课题得到教育部（博士点专项基金，新孢子虫表面蛋白 P43 、P36 的融合表达与免疫原性分析，20050019006 ）、 农业部（公益性项目，动物原性人兽共患弓形虫病防控技术研究，200803017）和国家自然科学基金（面上项目， 顶膜抗原 1 在犬新孢子虫侵入、发育中的功能研究）的资助。 1 1 引言 弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种危害严重的全球性人畜共患寄生原虫，自1908年 由Nicolle和Manceaux发现以来，引起了世界各国研究者的重视。近年来，弓形虫转基因技 术激发了人们很大研究兴趣。相比其它顶复门原虫，弓形虫的转基因技术日趋成熟，瞬时转 染和稳定转染均有报道。由于弓形虫遗传背景清楚，体外易于培养，瞬时转染效率高(30% —50%)，有较多可用的细胞标记便于细胞生物学研究，因此，弓形虫被认为是最佳的模式生 物之一[3] 。 基因转染研究中，如何监测基因在细胞水平的信号转导及基因表达产物的定性与定量检 测，需要简便、敏感和无放射性等危害的方法赖以实现，报告基因技术很大程度上解决了这 些问题。近年来，表达荧光素酶和荧光蛋白的两种报告基因，由于具有检测方法简便等特点， 如今已被广泛应用于基因的转染研究中[1] 。 报告基因在监测基因的转染和表达中起着重要的作用。鉴于不同种属原虫间基因转染的 复杂性，为明确转基因弓形虫高敏感性的报告基因，有必要不断优化和完善现有的报告基因 技术，来进一步提高现有活细胞水平基因转染情况监测能力[8] 。 已报道弓形虫转染的报告基因较多，如氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶 (LacZ)、分泌型碱性磷酸酶（SEAP）、荧光素酶(Luc)及绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白 [1] （RFP），以及 CAT-GFP 融合表达系统等 。然而，基于弓形虫不同启动子的叩甲虫荧光素 酶和荧光蛋白双报告基因，可否在弓形虫瞬时转染中实现同时定性和定量检测的研究尚未见 报道。 因此，本研究旨在筛选确定适于弓形虫瞬时转染的双报告基因系统，以期为将来弓形虫 稳定转染报告基因