课件：第八章发育毒性与致畸作用.ppt

二、两代(多代)生殖毒性试验 两代生殖毒性试验是指仅对两代动物成体进行染毒，即F0代直接接触受试物，F1代既有直接接触，也有通过母体的间接接触，第三代动物(子二代，F2)将在子宫和经哺乳接触受试物。三代及多代的研究也照此规定类推。 实验程序：F0代雄性于交配前4周接触受试物，雌性于交配前两周接触受试物并延续至哺乳期，以便FlA代经胎盘转运和经乳汁接触受试物，FlA代在断乳时处死、尸体解剖并检查出现的异常与畸形。断乳后的两周，仍然接触受试物的F0代雌鼠再繁殖产生第2窝F1B代。FlB代断乳后，随机选出部分F1B进行进一步生殖毒性研究。即FlB代在同一周龄接受同一剂量受试物，繁殖并开始下一个周期，产生F2A代。F2A代断乳时处死，检查。F1B代再繁殖，产生第二窝F2B代。如此提供了不断接触受试物的子代来源和开始下一代F3A和F3B。 多代（含三代）生殖毒性试验图解 结果评定：应依据观察到的毒效应，尸检和镜检的结果对生殖毒性研究的发现进行评价。评价应包括受试物的剂量与包括生育力、体征、体重改变、死亡数和其他毒效应在内的异常是否存在及其严重性之间的关系。生殖毒性试验进行适当，应提供NOAEL的良好估计和对生殖、分娩、哺乳和出生后生长等的了解。 多代生殖毒性试验可看作对处于繁殖期动物的毒性筛选试验，虽然它强调的是检测针对生殖的影响，但对检测作为与生殖和发育有关的生理变化的结果而发生的一般毒效的增强也是有用的。 多代生殖毒性试验的主要优点是能检测对生殖的间接或直接的范围广泛的毒作用。 第三节 发育毒物预筛试验 一、体内预筛试验 “生殖／发育毒性筛选试验”(Reproduction／developmental toxicology screening test)是1990年在伦敦的一次专家会上讨论和取得一致意见的，以后逐年完善，1995年正式在OECD化学品试验准则中确定下来。本法的依据是大多数出生前受到的损伤将在出生后表现为存活力下降和／或生长障碍。因此于仔鼠出生后，观察其外观畸形，胚胎致死，生长迟缓等发育毒性表现，而不进行传统常规试验中内脏和骨骼的检查，就可达到筛选的目的。本法所用动物少，检测终点少，实验周期短，但能提供有关化学物对生殖和／或发育可能发生影响的初步信息，是一种比较满意的发育毒物体内预测试验，并已有效地用于现有化学物的初筛。 实验程序：动物用性成熟大鼠，每性别每组至少10只，以期提供8只孕鼠和足够的子代。一般至少用三个试验组和一个剂量组，剂量间隔2～4倍。至少在交配前2周，两性别同时开始染毒，雄鼠持续染毒4周(包括交配前、交配期、直至处死)。由于雄鼠在交配前染毒期限有限，且生育力观察可能不是睾丸毒性的特别敏感的指标，因此必须进行雄性生殖器官仔细的组织学检查，以了解对雄性生育力和对精子发生的影响。雌鼠在整个研究期间染毒，包括交配前期、受孕、孕期和到分娩后4天，．以交配期满14天计，共54天。经口染毒。交配通常为1∶1，雌、雄鼠固定搭配。雄鼠一般在染毒4周后处死，母鼠和仔鼠在分娩后4天处死，未孕雌鼠在最后一次交配后24～26天处死。 生殖/发育毒性筛选试验图解 观察项目：雌、雄亲代应于染毒第一天以后，每周一次和终末处死前称重，仔鼠在出生0天，出生后1天和4天称重。测定交配前至哺乳期间的食物消耗量，当受试物经饮水给予时，还应测定此期间的饮水量。在染毒期每天观察毒性体征，研究期间死亡或终末处死的成年动物，应肉眼检查、称重并保存卵巢、睾丸、附睾和其他附件以及所有显示肉眼可见损伤的器官，Bouin’s固定，作组织病理学检查。仔鼠出生后，记录窝重、仔鼠数、性别、活产、死产、小仔，观察外观显著异常，以及亲代和子代的任何行为异常。 结果评定：根据观察到的毒性效应，尸检、肉眼和组织病理学发现，评价受试物的剂量与异常的发生和严重性之间的关系。包括大的损伤、证实靶器官、不育、畸形、对生殖和仔鼠行为的影响、体重改变和死亡率等。由于本试验的动物少，终点选择少和周期短，只能用作初筛。筛选结果即使是阴性的，也不表示对生殖／发育的绝对安全，虽然当实际接触剂量明显低于NOAEL剂量时，能提供可能安全的信息。而当结果是阳性的而又缺乏其它的生殖／发育毒性资料时，则有助于决定是否有必要进一步试验。 二、体外预筛试验 1. 大鼠全胚培养(whole embryo culture) 取9.5日龄大鼠胚胎，剥去Reichert膜，在培养液中接触受试物，在孵箱中通气旋转培养48小时后，观察心脏搏动和卵黄囊循环、轴向正常旋转在背凸位、尿囊和绒毛膜融合、眼囊和耳囊、前肢芽和三个腮弓、前后神经管闭合及体节数目等胚胎发育情况，记录胚胎存活。 2. 器官培养(organ culture)