课件：蛋白质粒子带负电荷.ppt

（二）电泳： 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳（electrophoresis) 蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。 电泳 蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 （1）纸上电泳：用滤纸作支持物。 （2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 （3）双向电泳 4）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。 + — 5）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。 - + 两种凝胶电泳 等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。分离同工酶 + + － － － － + － － － － － 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 通电 + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － + + － － － － + － － － － － SDSPAGE中SDS的作用： 阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态 屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷 使得蛋白质的形状趋于一致 所以在这种特殊的电泳中，迁移率与蛋白质电荷无关，与蛋白质的形状无关，处决于蛋白质的大小（分子量） （三）层析： 层析（chromatography)是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。 主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析、HPLC等。 凝胶过滤分离蛋白质 （四）超速离心： 利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。 蛋白质相对分子量在10 000-1 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25-50*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。 沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。 s = ———— v ω2x v =沉降速度（dx/dt） ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm） 沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s） 蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系 M = —————— RTs D（1－Vρ） R——气体常数（8.314×107ergs·mol -1 ·度-1） T——绝对温度 D——扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计） V——蛋白质的微分比容（m3·g-1） ρ——溶剂密度（20℃，g·ml-1） s——沉降系数 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶促反应速率 酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，U/ml） 在最适的反应条件（25℃）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即 1IU=1μmol/min 在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s 1kat = 6×107IU 蛋白质的表征 酶的纯度： 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白（氮） 纯化倍数 = —————— 每次比活力 第一次比活力 产率%（回收率）= —————— ×100 每次总活力 第一次总活力 酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 可编辑 可编辑 第三章 蛋白质的通性、纯化与表征 1、蛋白质的理化性质： 酸碱性质、胶体性质与沉淀、变性、颜色反应 2、分离纯化的方法： 盐析、电泳、等电聚焦、层析等 3、表征： 活力、比活力 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳 1、酸碱性质 阳离子 PHPI 阴离子 PHPI 兼性离子 PH=PI 可解离基团有末端和侧链 故pI与酸性、碱性氨基酸的数目有关 如胃蛋白酶