课件:蛋白质粒子带负电荷.ppt

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(二)电泳: 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳(electrophoresis) 蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷,故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所带电荷量不同,且分子大小也不同,故在电场中的移动速度也不同,据此可互相分离。 电泳 蛋白质在等电点pH条件下,不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象,可以将蛋白质进行分离纯化。 自由界面电泳:蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 2.区带电泳:将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳,不同组分形成带状区域。 (1)纸上电泳:用滤纸作支持物。 (2)凝胶电泳:用凝胶(淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺)作支持物。 (3)双向电泳 4)圆盘电泳:玻璃管中进行的凝胶电泳。 + — 5)平板电泳:铺有凝胶的玻板上进行的电泳。 - + 两种凝胶电泳 等电聚焦电泳:当蛋白质在其等电点时,净电荷为零,在电场中不再移动。分离同工酶 + + - - - - + - - - - - 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 通电 + + - - - - + - - - - - + + - - - - + - - - - - + + - - - - + - - - - - + + - - - - + - - - - - SDSPAGE中SDS的作用: 阴离子去污剂,变性,蛋白质伸展态 屏蔽蛋白质的电荷,都带负电荷 使得蛋白质的形状趋于一致 所以在这种特殊的电泳中,迁移率与蛋白质电荷无关,与蛋白质的形状无关,处决于蛋白质的大小(分子量) (三)层析: 层析(chromatography)是一种利用混合物中各组分理化性质的差异,在相互接触的两相(固定相与流动相)之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。 主要的层析技术有离子交换层析,凝胶层析,吸附层析及亲和层析、HPLC等。 凝胶过滤分离蛋白质 (四)超速离心: 利用物质密度的不同,经超速离心后,分布于不同的液层而分离。 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量,蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。 蛋白质相对分子量在10 000-1 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 最准确可靠的方法是超离心法(Svedberg于1940年设计):蛋白质颗粒在25-50*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。 沉降系数(s):单位(cm)离心场里的沉降速度。 s = ———— v ω2x v =沉降速度(dx/dt) ω=离心机转子角速度(弧度/s) x =蛋白质界面中点与转子中心的距离(cm) 沉降系数的单位常用S,1S=1×10-13(s) 蛋白质分子量(M)与沉降系数(s)的关系 M = —————— RTs D(1-Vρ) R——气体常数(8.314×107ergs·mol -1 ·度-1) T——绝对温度 D——扩散常数(蛋白质分子量很大,离心机转速很快,则忽略不计) V——蛋白质的微分比容(m3·g-1) ρ——溶剂密度(20℃,g·ml-1) s——沉降系数 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶促反应速率 酶(活力)单位:在一定条件下,一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。(U/g,U/ml) 在最适的反应条件(25℃)下,每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位,即 1IU=1μmol/min 在最适条件下,每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位,即 1kat=1mol/s 1kat = 6×107IU 蛋白质的表征 酶的纯度: 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白(氮) 纯化倍数 = —————— 每次比活力 第一次比活力 产率%(回收率)= —————— ×100 每次总活力 第一次总活力 酶的纯化鉴定:聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 可编辑 可编辑 第三章 蛋白质的通性、纯化与表征 1、蛋白质的理化性质: 酸碱性质、胶体性质与沉淀、变性、颜色反应 2、分离纯化的方法: 盐析、电泳、等电聚焦、层析等 3、表征: 活力、比活力 蛋白质与多肽一样,能够发生两性离解,也有等电点。在等电点时,蛋白质的溶解度最小,在电场中不移动。 在不同的pH环境下,蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中,蛋白质粒子带正电荷,在电场中向负极移动;在等电点偏碱性溶液中,蛋白质粒子带负电荷,在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳 1、酸碱性质 阳离子 PHPI 阴离子 PHPI 兼性离子 PH=PI 可解离基团有末端和侧链 故pI与酸性、碱性氨基酸的数目有关 如胃蛋白酶

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