课件：第四章-沉淀分离法.ppt

（3）无机酸沉淀法 （无机酸：能解离出氢离子的无机化合物，如硫酸、盐酸、硝酸、次氯酸等； 有机酸：具有酸性的有机化合物，最常见是羧酸） 某些无机酸如磷钨酸、磷钼酸等能与阳离子形式的蛋白质形成溶解度极低的复合盐，使蛋白质沉淀析出。 无机酸如何去除？ 得到沉淀物后，可在沉淀物中加入无机酸并用乙醚萃取，把磷钨酸、磷钼酸等移入乙醚中除去；或用离子交换法除去。 3.高分子聚合物沉淀 某些水溶性的非离子型高分子聚合物是20世纪60年代发展起来的沉淀剂，近年来被广泛用于核酸、蛋白质和酶的分离纯化，包括不同分子量的聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等。 应用最多的是PEG，原因：无毒，对成品影响小 （1）用水溶性非离子聚合物沉淀生物大分子和颗粒的两种方法： ① 选用两种水溶性非离子多聚物组成液-液两相系统，使生物大分子或颗粒在两相系统中不等量分配，进行分离。 机理：不同生物分子和颗粒表面结构不同，有不同分配系数；且外加离子强度、pH和温度等的影响，提高分离效果。 ② 选用一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子或颗粒在同一液相中，由于被排斥相互凝集而沉淀析出。 （2）PEG的沉淀 ① 机理 劳兰梯提出：通过空间位置排斥，使液体中的生物大分子、病毒和细菌等微粒被迫挤聚在一起而引起沉淀的发生。 ② 影响因素 PEG浓度： PEG相对分子质量： 离子强度： 蛋白质相对分子质量： pH： 温度： 与溶液中盐的浓度成反比 越接近蛋白质的pI，所需PEG浓度越低 高分子量的PEG沉淀效果较好 分子量越高，PEG越少 ③ 优缺点 优点：无毒，对成品影响小，所以广泛用于核酸、蛋白质、酶等的沉淀分离。 缺点：所得沉淀中含有大量PEG 去除蛋白质沉淀中的PEG 吸附法 乙醇沉淀法 盐析法 吸附法 沉淀物溶于磷酸缓冲液 用DEAE-纤维素离子交换剂吸附蛋白质 蛋白质再用KCl洗脱 透析脱盐 PEG不被吸附而除去 乙醇沉淀法 沉淀物溶于磷酸缓冲液 用20%乙醇沉淀蛋白质 离心（PEG留在上清液） 盐析法 沉淀物溶于磷酸缓冲液 用35%硫酸铵沉淀蛋白质 PEG留在 上清液 4.选择性变性沉淀法 破坏杂质，保存目的物。 原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，从而有选择的使之变性沉淀，分离纯化。 表面活性剂或有机溶剂引起变性 利用对热的稳定性不同 酸碱变性 ① 利用表面活性剂或有机溶剂变性。 如：制备核酸时，加入含水酚、氯仿、SDS等选择性的使蛋白质变性沉淀，从而与核酸分离。 ② 利用对热的稳定性不同，加热破坏某些组分，保留另一些组分。 如 热稳定性:DNase RNase，加热可使DNase变性沉淀。 简单可行，制备热稳定的小分子物质过程中，对于除去大分子蛋白质和核酸有效。 ③ 选择性的酸碱变性 如：用2.5%的TCA处理胰蛋白酶、抑肽酶或细胞色素c的粗提液，均可除去大量杂蛋白，而对所提取的酶活性无影响。 有时把酸碱变性和热变性结合起来，效果更好 沉淀分离法 课堂总结 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀 等电点沉淀法 成盐沉淀法 高分子聚合物沉淀 选择性变性沉淀法 原理、无机盐的选择（(NH4)2SO4）、影响因素（5个）、优缺点 原理、常用（甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮）、影响因素（4个）、优缺点 原理、使用时注意事项 金属离子沉淀法：3类 有机酸沉淀法：常用有机酸 无机酸沉淀法：常用无机酸 常用沉淀剂、影响PEG沉淀效果的因素、如何去除沉淀中的PEG 3种方法 课后题 1.使用等电点沉淀法、成盐沉淀法和选择性变性沉淀法各应注意什么问题? 2.PEG沉淀效果的影响因素有哪些？如何去除蛋白质沉淀中的PEG? THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 0 2 4 6 8 10 -0.50 0.50 -1.00 μ(离子强度) lgS 蛋白质溶解度 0 不同蛋白质溶解度与离子强度的关系 蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同 对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一定的蛋白质盐析分布曲线。 30 lgS 蛋白质溶解度 20 30 40 50 60 70 20 40 10 0 P—不同(NH4)2SO4 饱和度 C0 蛋白质沉淀的速度可用 - — 对盐饱和度（P）作图来表示： dS dP 6 20 30 40 50 60 70 4 8 2 0 dS dP