课件：第六章：蛋白质的分离纯化和表征.ppt

一．蛋白质的胶体性质 1．蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质是生物大分子相对分子量一般都在1-100万Da之间，其颗粒大小属于胶体粒子的范围。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：双电层和水化层； 第三节：蛋白质的胶体性质和沉淀 2. 蛋白质溶液是分散系统： 分散相是蛋白质分子颗粒，分散介质是水。 分散程度胶体系统，以分散相质点的直径来衡量 分散相质点真溶液（质点是分子，均相系统） 分散系统根据分散程度可分为： 3.分散相质点在胶体系统中保持稳定需三个条件： a． 分散相质点1-100nm b． 分散相质点带有同种电荷，互相排斥不聚成颗粒而沉淀 c． 分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层 4. 蛋白质的胶体性质： a.胶体质点的范围 c． 丁达尔效应d． 布朗运动e． 不能透过半透膜 二．蛋白质的变性作用 1.定义：在某些物理或化学因素作用下，天然蛋白质严密的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失（如酶失去催化活力，激素丧失活性），则称之为蛋白质变性作用。 一般认为蛋白质变性本质是次级键的破坏，只有空间构象的改变，并不涉及一级结构（共价键）的变化。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 2.引起变性的因素： 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂、尿素等 物理因素：加热、射线、超声波、剧烈震荡等 旋光值改变； 特性粘度增加； 溶解度降低； 扩散系数降低； 结晶能力丧失； 易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点则不一定沉淀； 变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化 3.变性后蛋白质的表现： 4.变性蛋白的复性 有些变性程度较轻的蛋白质经去除变性因素后，可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。这种变性称为可逆变性。 但许多蛋白质变性后并不能复性，称为不可逆变性。 三.蛋白质的沉淀： 1．概念 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。 2. 沉淀蛋白质的方法：① 盐析法：中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→ 蛋白质脱去水化层优点：不引起蛋白质变性② 有机溶剂沉淀法： 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→脱去水化层以及降低介电常数 而增加带电质点间的相互作用条件：低温操作，缩短时间③ 重金属盐沉淀法当溶液PHPI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀用途：抢救误服重金属盐的病人④　生物碱试剂和某些酸类沉淀法　生物碱试剂_－－能引起生物碱沉淀的一类试剂 当溶液PHPI时,蛋白质颗粒带正电荷→ 易与生物碱试剂,酸根负离子反应→沉淀 用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质 ⑤　加热变性测定法 原因：a． 加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层b． 蛋白质处于等电点破坏了带电状态。 用途：制豆腐（加热+少量盐卤） 四．蛋白质的颜色反应 1.双缩脲反应 双缩脲是两分子尿素经加热脱氨缩合生成的产物，两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物—双缩脲铜纳氢氧化物。这一呈色反应称为双缩脲反应。 一切蛋白质和两个肽键以上的多肽化合物都具有双缩脲反应。肽链越长显色越深，由粉红、紫红直到蓝紫色。 2.酚试剂反应（Folin－酚试剂） 酪氨酸、色氨酸还原磷钼酸、磷钨酸为蓝色化合物 微克水平 3.黄色反应 含有酪氨酸、色氨酸的蛋白质的特有反应 蛋白质溶液加入硝酸，产生白色沉淀，加热变成黄色沉淀。硝基苯衍生物 4.乙醛酸反应 蛋白质溶液加入乙醛酸，沿管壁慢慢加入浓硫酸，两相液面出现紫色环 色氨酸、含有色氨酸的蛋白 五．蛋白质的紫外吸收性质 一般蛋白质在280nm波长处都有最大的吸收率，这是由于蛋白质中有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故。 所有的蛋白对小于230nm波长的光波都有强烈的吸收。这是肽键的属性。 第四节：蛋白质分离和纯化 一．蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质提纯的总目标--增加制品纯度或比活性、即增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性 1. 前处理： 二．蛋白质的分离纯化方法 纯化蛋白质要根据蛋白质在溶液中的下列性质：分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对配体的生物学亲和力。 1．根据分子大小不同的纯化方法