课件：第五章固相析出分离法.ppt

* * 介电常数的大小反应介质对电荷电场信息阻隔的程度。 库仑定律现在的一般表述是：在真空中，两个电荷之间的相互作用力的大小，与它们所带电量的乘积成正比，与它们的距离的平方成反比。F=Kq1q2/r2????? 如果在两个点电荷之间加入介质，那么上述库仑定律就变成下述表达形式：F=q1q2/4πεr2（这里ε为介电常数）。 * 实际操作时往往先加溶媒沉淀除去杂蛋白，再加Zn2+沉淀目的物。 * * 单宁 ：选用比蛋白质更强的结合剂与单宁结合，使蛋白游离出 雷凡诺：吖啶燃料 * 氯化钠 沉淀雷凡诺 * * 与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白质的水化膜。 * 盐析---溶解度变化快，对结晶条件苛刻的蛋白，需要连续缓慢的浓度变化 * 等电点和盐析法有机溶剂法 一起使用 * 样品需量少 可形成颗粒大的单晶 摸索合适的结晶条件 * 青霉素钾盐不溶于有机溶剂 * 晶体会吸附母液及杂质 洗涤出去晶体表面的母液杂质等 * 柠檬酸从热水中结晶时，生成无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。 * 柠檬酸从热水中结晶时，生成无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。 柠檬酸是一种较强的有机酸，有３个Ｈ＋可以电离； 其钙盐在冷水中比热水中易溶解，此性质常用来鉴定和分离柠檬酸。 在柠檬酸发酵液中，除了主要产物外，还含有其他代谢产物和一些杂质，如草酸、葡萄糖酸、蛋白质、胶体物质等，成分十分复杂，必须通过物理和化学方法将柠檬酸提取出来。大多数工厂仍是采用碳酸钙中和及硫酸酸解的工艺提取柠檬酸。 * 冷乙酸：酸性条件下提取 用硫酸调pH原因 硫酸铵：盐析 氯化钙作用： 激活的原理 * 黄血盐作用 硫酸锌作用 pH1.7-1.8原因 滤液成分 * 浓氨水作用 温度原因 pH作用 ：等电点 沉淀成分 3.晶体纯度 母液中的杂质 晶体越细小，杂质越多 洗涤有利提高纯度 结晶速度过快，易产生“晶蔟”，包含杂质 杂质对晶体的成长速率的影响较为复杂，有的杂质能抑制晶体的成长，有的能促进成长，有的能改变晶型。 4.晶体结块 原因： 粒度不齐、空气湿度高、温度高、受压、贮存时间增长 措施： 控制粒度分布、良好外形、干燥密闭容器贮存 5.重结晶 晶体用合适溶剂溶解后再次结晶，提高纯度 用于生物物质重结晶的溶剂一般有蒸馏水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低级醇等。 结晶是分离纯化蛋白质、酶等生化产品的一种有效手段。变性蛋白质不能结晶，所以凡结晶状态的蛋白质都能保持天然状态。 * 南京农业大学 生命科学学院 * * * 南京农业大学 生命科学学院 谷氨酸结晶 固相析出法的应用 例1：尿激酶的沉淀分离 尿激酶：分离方法包括沉淀法、吸附法、层析法 沉淀法： 金属离子形成复合盐 脱盐 盐析 Zn 离子沉淀尿激酶 低浓度时，zn 能选择沉淀尿激酶。在3mM可得85-92 回收率，而沉淀物的量并不多； 加大Zn 浓度虽然能提高有限回收率，但沉淀物量大，纯度降低。 沉淀量 酶活 EDTA 溶出效应 硫酸铵溶解尿激酶锌络合物 硫酸铵的选用 1)它在低浓度时可能有盐溶作用，促进沉淀蛋 白溶解； 2)因为本身有NH4+，与Zn 2+有络合作用，有 利于沉淀物溶解； 3)硫酸铵为盐析所用，在最终盐析中，只需补 加规定量即可，而不引入其他成分。 尿激酶盐析沉淀 沉淀量 回收率 纯度 例2：柠檬酸的生产 柠檬酸是一种重要的有机酸，它在食品、医药、化工、皮革、环保等工业部门都有广泛的用途。 目前柠檬酸极大多数是通过微生物发酵法（黑曲霉）生产， 提取工艺中，目前大多通过沉淀法制备（碳酸钙沉淀及硫酸酸解） 标准沉淀法回收柠檬酸流程图 加热到70度 pH1.8~2.0 过滤 例3：胰蛋白酶的提取 从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺 胰蛋白酶原的溶解：酸性条件下稳定 溶解液中含有大量的酸性杂蛋白（pI10.8) 浓缩分离胰蛋白酶原（盐析） 溶解激活（酶原-酶） 胰蛋白酶的进一步分离：酶溶液中糜蛋白弹性蛋白等与胰蛋白酶在不同的盐浓度下溶解度不同 胰蛋白酶的提取 （二）胰蛋白酶原激活 滤饼溶解, 加入无水CaCl2,边加边搅拌,最终含有0.1M CaCl2； 5MNaOH调pH至8.0,加极少量胰酶搅拌，于室温下活化8～10小时； 活化完成，用2.5M H2SO4调pH至2.5-3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。 （一）猪胰蛋白酶原的提取 胰脏绞碎加入2倍体积冷乙酸 (pH2.5)低温搅拌24小时，过滤； 滤液用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后，用滤纸过滤； 滤液加入硫酸铵,达0.75饱和度放置过夜抽滤，得酶原粗制品。 （三）胰蛋白酶的分离 将激活溶液加入固体硫酸铵,达0.4饱和度,数小时后抽