课件：第章基因工程改.ppt

优点：简单、省时、省钱 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 很难表达大量可溶性蛋白 1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用） 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、不经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2. 真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 * * * * * 几种不同的末端 名　　称　　 　识别序列及切割位点 名　　称　　　　　识别序列及切割点 切割后产生５’突出末端: BamHⅠ 5’…G▼GATCC...3’ Bgl Ⅱ 5’…A▼GATCT...3’ EcoR Ⅰ 5’…G▼AATTC...3’ Hind Ⅲ 5’…A▼AGCTT...3’ Hpa Ⅱ 5’…C▼CGG...3’ Mbo Ⅰ 5’…▼GATC...3’ Nde Ⅰ 5’…GA▼TATG...3’ 切割后产生3’突出末端: Apa Ⅰ 5’…GGGCC▼C...3’ Hae Ⅱ 5’…PuGCGC▼Py...3’ Kpn Ⅰ 5’…GGTAC▼C...3’ Pst Ⅰ 5’…CTGCA▼G...3’ Sph Ⅰ 5’…GCATG▼C...3’ 切割后产生平末端: Alu Ⅰ 5’…AG▼CT...3’ EcoR Ⅴ 5’…GAT▼ATC...3’ Hae Ⅲ 5’…GG▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’…CAG▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’…CCC▼GGG...3’ 限制性内切核酸酶 同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A 同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ 二、基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 克隆载体(cloning vector) 为使插入的目的基因被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的目的基因可表达成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 最少需要启动子 理想载体的选择标准 ⑴能自主复制； ⑵有遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定 ⑶常具有多个酶的单一酶切位点，称为多克隆位点； ⑷表达型载体应配备与宿主细胞适应的启动子、增强子等。 1. 质粒 (plasmid) 特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状（如抗药性等）。 质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 pBR322质粒DNA THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。 2. 噬菌体(phage) pUC19 2686bp ampr Gsul 1874 Ctr 101 1779 Ppal 1766 Ori Amll 806 Xmnl 2294 Scal 2177 Spal 2501 Aatll 2617 EcoO1092674 0 Ndel 183 Narl 235 LacZ′ 396 447 EcoRI Sacl Kpnl Smal Xmal BamHI Xbal HincII PstI SphI HindIII