课件：免疫亲和纯化和免疫沉淀.ppt

免疫沉淀的特点： 1、确定抗原的存在、质量、大小、转换、修饰及相关性； 2、多个步骤共需1/2-1天； 3、半定量到定量； 4、敏感性取决于抗原的相对质量及抗体的亲和力； 5、需要高亲和力的抗体。 免疫沉淀的主要影响因素： 1、抗原原液的丰度 2、抗体对抗原的亲和力 合适抗体的选择 多克隆抗体 单克隆抗体 混合单克隆抗体 反应强度 极好 极差到极好 极好 特异性 良好 极好 极好，存在交叉反应 优点 稳定，多价反应 特异，供应不受限制 兼备 缺点 本底不易清除 需对抗原有高亲和力 供应不普遍 免疫沉淀步骤： 一、抗原溶液的制备 二、裂解物非特异性本底的预处理 三、免疫复合物的形成与纯化 /courses/genomics/IMPfolder/IMPQ.html 一、抗原溶液的制备 1、裂解细胞： 细胞裂解过程中有多种蛋白酶释放，会导致蛋白质的降解从而影响免疫沉淀，解决方法有两种：低温操作或加入蛋白酶抑制剂。 2、裂解液的选择： 　裂解条件应尽量温和，以保护抗体结合位点及避免蛋白的溶解，但裂解条件又应足够剧烈，以保证抗原的定量释放。对于去污剂的使用，非离子型优于离子型，低浓度优于高浓度，单离子优于混合型。免疫沉淀最常用的去污剂是NP40和RIPA，它们能释放大部分可溶性的胞浆蛋白和核蛋白，而且不损伤染色体DNA。最好不要释放DNA，因其影响溶液的粘着性。 3、裂解原则：在释放尽可能多抗原、引起尽可能少蛋白变性的前提下，将可溶性抗原从基质颗粒中分离出来，并且要避免和消除大分子DNA进入溶液。 4、裂解方法： 　组织培养细胞的裂解：最普遍的问题是抗原不能完全从细胞中释放。一般不推荐冻融法，因反复冻融会使蛋白质过量降解，原因不明。机械性剪切（使用超声波发生器、Dounce匀浆器、波特器和搅拌器等）特别适用于大体积制备或需避免使用去污剂时。最有效的方法是用去污剂处理。 　细菌的裂解：最常用的方法是将细胞进行短促和高频率的超声处理，可以破坏几乎所有的细菌细胞壁，并能剪切DNA微小分子，不影响样品的粘稠性，容易操作，样品质量好，费用低。最常见的问题是裂解时蛋白质抗原可能发生变性。 　酵母细胞的裂解：最好方法是将玻璃微珠和酵母细胞一起涡旋震荡进行机械破碎。此法充分利用玻璃微珠的快速转动撞击酵母菌从而机械破碎裂解酵母细胞，是一种强有力的裂解方法。最常见的问题是蛋白质抗原的变性。 　变性裂解：对不同来源的抗原，一个有效的裂解方法是用强烈的变性溶液处理细胞，以释出大部分蛋白质抗原。然后将裂解物经过稀释或透析降低变性条件，使其适于形成抗原抗体复合物。最主要的问题是许多抗体不能识别完全变性的蛋白质抗原。 　5、裂解物的预处理：将裂解物通过一系列模拟免疫沉淀的步骤，将不能识别靶抗原的抗体加入裂解物内，如同正常免疫沉淀进行操作，去除所有可能污染免疫沉淀最后步骤的非特异蛋白。优点主要是降低非特异本底，缺点是费时。如最后检测是免疫印迹则无需此步。 6、免疫复合物的纯化： 　影响因素： (1)抗体的用量； (2)免疫沉淀的体积； (3)蛋白A与蛋白G的选择。 蛋白A 蛋白G 母牛 √ 狗 √ 驴 √ 山羊 √ 豚鼠 √ 马 √ 人 √ 小鼠 √