课件：第五章酶的提取及纯化.ppt

2、稳定酶的方法 添加底物、抑制剂或辅酶； 添加SH-保护剂。如谷胱甘肽、DDT、二巯基乙醇、EDTA； 添加蛋白质； 添加低分子的无机离子； 添加蛋白酶抑制剂。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 具有盐析作用的中性盐很多，MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4是常用的盐析剂，其盐析蛋白质的能力随蛋白质种类而异，但一般说来这种能力按以上顺序依次增大。 表2-1 利用盐析方法分步分离蛋白质各组份和溶液中蛋白质实际浓度有很大关系。例如一种蛋白质在溶液中的浓度为C1加入中性盐，浓度直至离子强度等于I1时，蛋白质开始沉淀并从溶液中析出。此时等式3-3可写作： LogC1＝—K2I1 这里的I1是蛋白质开始沉淀时的离子强度。 但如果这种蛋白质在溶液中含量较低(设其浓度为C2)，则需要加人较多的中性盐，蛋白质才开始沉淀。(设此时离子强度为I2)应写作： LogC2＝—KsI2 Log（C1/C2）＝Ks（I2-I1） 所以在不同浓度的蛋白质溶液中进行盐析，使用硫酸铵的饱和度范围是不同的。高浓度蛋白质溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质由于“”和“Ks”常数十分相近，若蛋白质浓度太高，会发生严重的共沉作用。 但在低浓度蛋白质溶液液中盐析，所用的盐量较多，而共沉作用比较少，因此需要在二者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉作用减至最低限度，当然浓度不能太稀，一般认为2．5一3．0%的蛋白质浓度比较适中，如果蛋白质浓度太稀，消耗大量的中性盐，对蛋白质的回收也有一定的影响。 在低离子强度下，许多蛋白质比在纯水中的溶解度大大增加，但当溶液中离子强度不断增加时，各离子之间及离子与溶质分子之间相互竞争水分子，结果导致溶质的溶解度渐渐减少，产生盐析现象。一般来说离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。但蛋白质的盐析现象比一般有机分子复杂一些，蛋白质分子大，而且有许多表面电荷，这些表面所带电荷常随着周围离子和溶剂分子排列秩序的影响而不断变化着，蛋白质分子内还有许多相互作用的基团，这都造成了许多经典理论不能十分完美地解释蛋白质盐析的原因。 几种蛋白质在不同离子强度下的盐析效应见图3—l，从图中可以看出，当硫酸按饱和度达到20%时，纤维蛋白原首先析出，饱和度增至28—33%时，血红蛋白析出，饱和度再增至33—35%时，拟球蛋白析出，饱和度至50%以上，清蛋白析出，饱和度最后达到80%时，肌红蛋白析出。可见不同蛋白质发生盐析时所需求的离子强度是不同的。所以用不同离子强度分步盐析的方法，就可以分离混合物中各种组份。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度，顺次进行。每一组份被盐析出来后。经过固—液分离(冰冻离心或过滤)，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组份盐析出来。离子强度的大小对蛋白质的溶解度起着决定性的影响。但在同样的离子强度下，离子种类的不同对蛋白质溶解度的影响也不同。图3—2所示是七种不同电解质下，一氧化碳血红蛋白溶解度曲线。图中不同离子种类对蛋白质溶解度的影响，可以从Hofmeister系列理论中获得解释： 即离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱。单价盐如KCl，NaCl的盐析效果一般比较差。图3—3表示不同盐类对同一蛋白质的盐所效应具有不同的“Ks”值，Ks值可由各种益的盐析曲线的斜率表示。它们的减少顺序是：磷酸钾＞硫 酸钠＞硫酸铵＞柠檬酸钠＞硫酸镁。按照Hofmeister系列，镁离子比铵离子小，但实际上硫酸铵的盐析效应比硫酸镁好，主要是镁离子在同离子强度下产生了一层颇大的离子雾，从而减少了它的盐析效应。 雾，从而减少了它的盐析效应。 一股地说，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大；如果所带的电荷减少至接近于零时溶解度最少，我们称此时的pH值为该蛋白质的等电点(PI)。改变pH或特异地加入与蛋白质极性基团结合的离子(叫反离子)即可改变蛋白质的带电性质，也就是改变了蛋白质的溶解度。图3—4是在不同pH的浓磷酸盐缓冲液下血红蛋白的溶解度曲线。从图中曲线可见，蛋白质在不同的pH下有着不同的溶解度，远离等电点处蛋白质的溶解度最大，等电点处溶解度最小。因此在盐析时常选择溶液pH值在该蛋白质等电点附近。但必须注意在水中或稀盐溶液中测得的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的。需根据实际情况调整pH值至蛋白质溶解度最低处，才能使盐析获得更好效果。 温度是影响溶解度的重要因素，对于许多无机盐和小分子的有机化合物，温度升高，溶解度也相应增大。但对于蛋白质、酶等生物大分子在高离子强度溶液中，温度的升高，它们的溶解度有时不但不升高。反而减少。许多蛋白质