透明质酸的生产工艺.doc

基础研究资料??生产工艺 透明质酸的生产工艺 凌沛学 主编 张天民 主审 .《透明质酸》. 北京：中国轻工业出版社 ??透明质酸（HA）的生产工艺主要分为二大类,以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。透明质酸在动物组织中的分布较为广泛，几乎所有的动物组织中均含有透明质酸，只是含量不同。已从下列组织中分离出了透明质酸：结缔组织、脐带、皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉等，但考虑到原料透明质酸含量的高低、数量的多少和易于取得的程度等成本因素，能够用于生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球。细菌发酵法是利用某些种属的链球菌，在生长繁殖过程中，向胞外分泌以透明质酸为主要成分的荚膜。细菌发酵法与动物组织提法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中透明质酸以游离状态存在,易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。透明质酸无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的透明质酸，在化学本质和分子结构上是一致的，只是相对分子质量（Ｍr）有差别。 一、以雄鸡冠(roostercomb)为原料的生产工艺[1~4] ??（一）工艺路线 ??（二）工艺过程 ??1．提取冻鸡冠解冻后，用绞肉机绞碎，加适量水用胶体磨磨成糊状，按每1kg鸡冠加水8L，加氯化钠80g，搅拌加热至90℃，保温10min，冷却至50℃ ??2．过滤将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液。 ??3.乙醇沉淀和粗品干燥取滤液,调pH6.0~6.5,将滤液加到3倍体积的95%乙醇中,反复倾倒3次,待纤维状沉淀充分上浮后,取出沉淀,用适量乙醇脱水3~5次,放入有五氧化二磷的真空干燥器内干燥,得透明质酸中间品。 ??4．氯仿处理将透明质酸中间品溶于0.1mol/L氯化钠溶液中,溶解浓度为0.3%,溶解过程中加少量氯仿防腐。溶解后，调pH4.5~5.0,加入等体积的氯仿搅拌处理2次,静置分出水相。 ??5．酶解将水相用稀氢氧化钠溶液调pH7.5,加入适量链霉蛋白酶,37℃ ??6．络合沉淀酶解结束后，向酶解液中加入同体积的1%氯化十六烷基吡啶（CPC）溶液，静置，收集HA-CPC络合沉淀。 ??7．解离将HA-CPC络合沉淀加入0.4mol/L氯化钠溶液中,搅拌解离5~10h。 ??8．过滤解离液先用硅藻土过滤至清,再用0.2μm微孔滤膜精滤。 ??9．纯沉淀、真空干燥将滤液加至3倍体积的95%乙醇中，反复倾倒3次，取出纤维状HA沉淀，脱水，五氧化二磷真空干燥，得HA精品。 ??（三）工艺说明与讨论 ??1．对原料的预处理，鸡冠应洗净后冷冻储藏。也可用丙酮脱水处理或储存，这样可除去大部分脂肪等杂质，以利于后面的分离纯化，但成本加大。 ??2．鸡冠绞碎后用胶体磨处理时，注意不要磨得太细，以减少机械剪切力对透明质酸的降解。磨成糊状后，可先用水提取，过滤除去鸡冠残渣得提取液，然后进行酶解除蛋白质；也可将水提取和蛋白酶水解同时进行。后者的提取效率高，几乎达到完全提取，但提取液中的杂质含量也较高。提取时，可在水中加入1%的氯化钠。加热至90℃ ??3．透明质酸的提取液粘度较大，过滤速度较慢，可采用先粗滤后精滤，并加纸浆、硅藻土或活性炭助滤。 ??4．醇沉淀是分离提纯透明质酸、肝素、硫酸软骨素等粘多糖最常用的方法之一，在制备过程中，可多次重复使用，类似于重结晶的作用，每次醇沉淀操作，都使透明质酸的纯度有所提高。不同最终浓度的乙醇沉淀操作还可对不同Ｍr的透明质酸进行分级分离，在较低乙醇浓度下，低Ｍr的透明质酸不易被沉淀出来，Ｍr越高，越容易被沉淀。在从水溶液中用甲醇或乙醇沉淀透明质酸或其它粘多糖时，必须有盐的存在，一般为1%左右的氯化钠。沉淀形态有纤维状和无定型粉末状两种形态,纤维状透明质酸容易制备,形态疏松,易于脱水和真空干燥,缺点是使用时，溶解速度慢，若在常温下溶解成1%的水溶液，需要3~7d。制备无定型粉末状沉淀，需控制料液的盐浓度、料液和乙醇的混合速度及搅拌速度等诸多因素，工艺较复杂，但粉末状透明质酸溶解速度快，使用方便。 ??5．第一次乙醇沉淀、脱水、真空干燥所得透明质酸产品，可作为化妆品用保湿剂（参见第十章）。 ??6．上述产品透明质酸进行进一步精制时，可以使用干燥的产品，也可使用乙醇沉淀后未干燥的产品，这样可以缩短生产周期。 ??7．氯仿可使蛋白变性沉淀，利用此作用可除去一部分蛋白质杂质。氯仿处理的另一个重要的作用，是除去致炎物质。如细菌内毒素是一种脂多糖（lipopolysaccharide），其分子兼具脂溶性和水溶性，在进行氯仿处理时，聚集在氯仿和水的界面，利用这一性质可除去细菌内毒素。另外，加快搅拌速度，可提高氯仿在水中的分散度，极大地扩大氯仿和水的界面面积，提高去除细菌内毒素等致