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流式细胞技术 和流式细胞仪 流式细胞仪 HYPERLINK ../html/zskcframe.html首页 → 第十一章 流式细胞技术和流式细胞仪 一、荧光染料在流式细胞术中的应用 （一）碘化丙啶染色 碘化丙啶(propiolium iodide，PI)能嵌入DNA双螺旋中，可使荧光强度增加约20倍，以488nm波长激发，DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。 1. 小鼠Lewis肺癌细胞DNA含量测定方法 （1）从C57BL/6小鼠上切除肿块，在培养皿内用PBS冲洗。 （2）去除结缔组织及脂肪，剪碎肿块。 （3）小碎片移入1.20×38mm注射针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。 （4）将200～300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL)，染色3LL细胞，于4℃ （5）测定580～750nm之间的发射荧光，以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。 注：PI染色液：0.1%柠檬酸钠1000mL+PI 5mg + 1% Nonide P40水。 2.培养细胞DNA的流式细胞仪分析 （1）从培养皿中吸去培养基，以HBSS冲洗二次。 （2）加入PI5mL于培养皿中，在4℃放10分钟。 （3）用吸管反复次打细胞，使细胞破坏，胞核释放出来，再行流式细胞仪分析。 3. 完整细胞DNA的PI染色 （1）70%乙醇固定的细胞悬液，离心，去固定液。 （2）室温条件下加入PI染色一批细胞（105～106细胞/mL），时间为30分钟，然后行流式细胞仪分析。 （二）吖啶橙染色 1. DNA和RNA的鉴别染色 利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下： （1）试剂： 1）溶液A：低温保存，稳定期约2周。 Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL 8mL 1mol/L NaCL 15ml蒸馏水76mL，PH 1.5（100mL） 2）溶液B：稳定期数月，最好除菌以后(高压或过滤)贮存。 0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L NaCL 15mL 0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL 蒸馏水24mL，总体积为99mL pH6.0 3）吖啶橙母液： 用吖啶橙/蒸馏水配成1mg/mL(致癌物，应小心)，吖啶橙应用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀释。 4）注意事项：仪器鞘流系统应保持4℃。 氩激光激发波488nm，红色荧光为DNA(F600nm),绿色荧光为RNA或单链DNA(F530nm) （2）方法： 1）用含15%血清的PBS配制细胞悬液，取0.2mL(8×106细胞/mL)，加入0.4mL溶液A，4℃放置45～60秒。 2）加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室温2分钟。 3）应在加入溶液B后10分钟内进流式细胞仪分析。 （3）注意事项：（1）细胞数保持恒定；（2）核酸与吖啶橙的比例；（3）染色时间及温度。 2. 单链和双链DNA的鉴别染色 （1）试剂： 1）HBSS内含1000u/mL RNA酶A，0.2mol/L KCl pH1.35 2）吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4缓冲液，pH2.6。 （2）方法 1）2×106细胞悬于1mL HBSS/RNase液中。 2）37℃温育1小时。 3）将0.2mL细胞悬液(含4×105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混匀，20℃ 30分钟。 4）加2mL吖啶橙染色2分钟。 5）绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA含量。 （三）Hoechst33258染色 以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料进行细胞周期分析。 1.试剂： （1）用培养基配制33 mg/L Brdu及脱氧细胞苷26.4g/mL。 （2）染色液：Hoechst33258溶于PBS，细胞染色24小时后进行分析，据报道染色的稳定时间在30分钟至24小时之间。 2.方法： （1）将Brdu溶液按1:10加入细胞培养液中。 （2）根据细胞周期时间不同，选择不同时间培养的细胞。 （3）孵育后，摇散细胞以传代培养。 （4）直接用染液重悬细胞，进入流式细胞仪分析。 Hoec