液相色谱进阶讲座之梯度洗脱.doc

梯度洗脱Gradient Elution1 简介 ? 通常情况下，液相色谱操作中的流动相组成和比例是恒定的，这种洗脱化合物的方式被称为等度洗脱；但是为了改善分析结果，某些操作需要连续改变流动相中各溶剂组分的比例以连续改变流动相的极性，使每个分析组分都有合适的容量因子k，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离，这种洗脱方式称为梯度洗脱。2 梯度洗脱的应用梯度洗脱可在下列情形中发挥重要作用：A 在等度下具有较宽k值的多种样品分析。B 大分子样品分析。C 样品含有强保留的干扰物，在目标化合物出峰后设置梯度洗脱，将干扰物洗脱出来，以免其影响下一次分析。D 单组份化合物方法建立时，不知道其洗脱情况，使用梯度洗脱，找出其较优的洗脱条件。 (1)多组分分析时，这些组分往往具有很宽的k值范围。假如使用等度洗脱，这些化合物的k值无法同时落在1~10之间，结果就是，无法同时得到较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值。 ? 图T1、T2、T3是笔者不同条件下分析邻苯二甲酸酯类化合物得到的色谱图。 ? 图T1??(等度，流动相：80%乙腈水溶液)? 图T2 (等度，流动相：100%乙腈) 图T3 (梯度，0-5 min，乙腈由70%上升到90%，5-10 min乙腈由90%上升到100%，10-18min，乙腈100%)其他色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18(2)，250*4.6 mm，5 μm流速：1.0 ml/min检测器：UV254 nm1 邻苯二甲酸二甲酯(DMP)2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP)3 邻苯二甲酸二正丙酯(DPrP)4 邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)5 邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)6 邻苯二甲酸二戊酯(DPP)7 邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)8 邻苯二甲酸二己酯(DHP)9 邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP) 三种洗脱方式对比： 条件 最小分离度 分析时间 灵敏度 等度1(T1) ＞4 ＞100 min 1-9，灵敏度逐渐降低，8和9难以检出 等度2(T2) ＝0.8 11 min 1-9，灵敏度逐渐降低，均较高 梯度(T3) ＞3 25 min 1-9，灵敏度相差不大，均较高 由该分析案例可知，在多组分分析时，只要能够选出合适的梯度条件，就能够实现“较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值”。 (2) 样品溶液中同时含有目标化合物和强保留化合物，目标化合物流出后使用梯度洗脱将强保留化合物洗下来，以避免强保留化合物污染色谱柱或在后续的分析中流出干扰分析。T4 某分析项目末端梯度洗脱以洗掉过剩的衍生试剂(末端梯度：39-40 min，有机相含量由38%升高到80%，保持10 min)。 ? ? 由T4可以看出，40 min左右，最晚出峰的组分已经被洗下来，然而却把有机相在1 min内由38%升高到80%，目的就是为了洗脱衍生反应剩余的衍生试剂(50 min处的色谱峰)。前面的杂质峰为样品基质中的强保留干扰物，末端的梯度洗脱同样也将其洗了下来，这就避免了这些化合物在随后的分析中缓慢流出造成的基线起伏。 (3)当遇到新的化合物需要分析，我们没有文献可以参考，只能初步圈定分析模式(反相、正相等等)，此时确定不了等度洗脱的流动相组成和比例，借助梯度洗脱可以较快找出合适的洗脱体系。。 3 梯度洗脱的原理(以反相色谱为例)梯度洗脱的实质就是，样品随梯度起点的流动相进入色谱柱入口，由于起点流动相中强洗脱溶剂B含量较低，化合物C1(保留性适中)和化合物C2(保留较强)因k值较高而滞留于色谱柱入口附近(几乎未移动)。一段时间后，B增加到一定数值，C1的k值达到足够小(比如小于10)，其在柱中的移动速率明显增大，并且随着B的增加，其移动速率愈加快速，直到tC1时流出色谱柱，被检测器检测到并被记录成色谱峰C1，tC1虽然比等度时的保留时间长很多，但C1的的平均k值却很小，因而色谱峰并未展宽，灵敏度仍处于较高水平。B持续增加，在随后的某个时间点，C2的k值也降到10以下，C2的移动速率也开始变快，以与C1类似的方式于tC2被洗脱出色谱柱，其平均k值同样很小，色谱峰亦未展宽，灵敏度处于较高水平。 ? T5 梯度洗脱过程中的峰迁移  黑色虚线代表B比例的变化(对应左侧上方纵轴)红色曲线代表化合物k值随流动相改变而发生的变化(对应右侧纵轴)绿色曲线代表化合物化合物在柱中的位置变化(对应左侧下方纵轴)紫色曲线为色谱图 4 梯度分离的建立梯度洗脱可以按下列步骤建立：A 选择初始条件：色谱柱(类型和规格)、流动相组成、流速、柱温等等B 根据A的分析结果升高起始流动相中的B%并降低