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2-疏水层析HIC课件
疏 水 层 析 (HIC) 一 实验原理 疏水层析(Hydrophobic Interaction Chromatography HIC) 是利用被分离 样品中不同生物分子表面的疏水性差别,而将其分离纯化的一种层析技术。疏 水层析的介质通常是一类在惰性支持物上接有疏水基团的层析载体,如苯基琼 脂糖(Phenyl Sepharose), 辛基(Octyl),丁基(butyl) 琼脂糖等。 对于不同的蛋白质和多肽而言,其分子表面一般有着不同的疏水和亲水结构 区域,当将这些生物样品加入到含有高盐(高离子)浓度缓冲液的HIC 柱中时, 由于溶液中高浓度盐离子与水分子的作用,降低了样品分子的溶剂化作用,从而 增加暴露了样品分子表面的疏水区,这样就促使样品分子表面疏水基团与HIC 柱 上的疏水基团相互作用结果使样品被吸附到HIC柱上。因此疏水层析亦称疏水相 互作用层析。样品吸附在 HIC柱上的强弱程度,取决于样品本身的疏水性质和样 品环境中盐离子的强度。 一般来说疏水性强的只需要较低的盐浓度,疏水性弱的则需要较高的盐浓度 [如1.0 mol/L (NH4)2SO4]。吸附在HIC柱上的生物分子,可以采用降低洗脱液中 盐浓度的方法,使其从柱上洗脱下来,洗脱方法可以是梯度也可以是阶段洗脱的 方式。样品中不同分子被洗脱的顺序依据其疏水性强与弱从先到后,从而达到分 离的目的。 二 实验目的与要求 通过苯基琼脂糖疏水层析柱,采用阶段洗脱的方 式分离——血红蛋白,以此了解疏水层析的原理、方法 和实际的应用。 三 实验仪器与器材 3-1、实验仪器 (1)、层析工作站装置 (2)、笔记本电脑 (3)、紫外检测仪 (4)、磁力搅拌器 (5)、恒流泵 (6)、天 平 (7)、混合器 3-2、实验器材 (1)、 可调取液器 (2)、 量 筒 (3)、 烧 杯 (4)、 层析柱 (5)、 吸 管 (6)、 吸管架 (7)、 滴 管 (8)、 剪 刀 (9)、 镊 子 (10)、 玻 棒 (11)、 骨 勺 (12)、 洗耳球 (13)、 称量纸 (14)、 吸水纸 (15)、 保膜鲜 (16)、 标签纸 (17)、 记号笔 四 试剂与配制 4-1、实验试剂 (1)、BSA (2)、苯基琼脂糖 (3)、磷酸氢二钠 (4)、磷酸二氢钠 (5)、硫 酸 铵 (6)、无水 乙醇 4-2、试剂配制 (1)、Buffer A(0.02 mol/L pH7.2磷酸缓冲液含1.0 mol/L硫酸氨)的配制: 分别称取Na2HPO4___ 克, NaH2PO4___克和[NH4 ]2SO4___ 克于一烧杯 中,先用少量蒸馏水溶解,最后用蒸馏水稀释至100毫升,混匀即可。 (2)、Buffer B(0.02 mol/L pH7.2 磷酸缓冲液)的配制: 分别称取Na2HPO4 ___ 克和NaH2PO4___克于一烧杯中,先用少量蒸馏水溶 解,最后用蒸馏水稀释至100毫升,混匀即可。 (3)、乙醇(20%)溶液: 取20.0 ml无水乙醇,然后加80.0 ml蒸馏水,混匀即可。 (4)、样品(10mg/ml)溶液: 称取10.0 mg BSA,加1.0 ml Buffer A溶液溶解[如有不溶物质, 需在8000rpm离心5分钟,取上清作为上柱样品,本品易溶]。 五 实验步骤 5-1、苯基琼脂糖[Phenyl Sepharose]
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