核酸测序技术课件.ppt

核酸测序技术 基因工程研究所 Sanger双脱氧链终止法 Sanger于1977年在加减法测序的基础上创建了双脱氧链末端合成终止法（chain termination method），简称Sanger法、双脱氧法或酶法。 一、基本原理 利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列 。 双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸为测序反应的链终止剂。 在4组相互独立的测序反应体系中，分别加入四种不同ddNTP，其余成分相同。调整每个测序反应中dNTP与ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于待测模板DNA每个可能掺入的位置都有可能发生终止。 产生4组分别终止于互补链3′末端的每一个A、G、C和T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测，直接读出新合成DNA链的序列。 二、测序反应体系的组成 （一）待测模板 1．单链模板DNA Sanger法使用的经典测序反应是将待测DNA片段克隆于M13mp载体中，得到单链的DNA模板，再按Sanger法进行测序。 2．双链模板DNA 将待测的DNA片断克隆到质粒载体上，得到含待测DNA克隆片断的双链质粒，通过碱变性处理，再与寡核苷酸引物序列一起退火，然后按Sanger法进行测序。 PCR产物 （二）引物 在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物。不论是单链DNA模板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“通用”引物。 通用引物的长度一般为15～30个核苷酸。 （三）DNA聚合酶 1．大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段） Klenow片段酶是Sanger法最早使用的DNA聚合酶，具有5′→3′聚合酶和3′ → 5′外切酶活性，但它催化链延伸反应的能力较差，用它进行测序常产生较高的本底和假带。 2．测序酶（sequenase） 测序酶是一种经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，消除了3′→5′外切酶活性。该酶活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长DNA的首选酶。 3．Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶是PCR反应的关键酶，在95℃的高温下保持稳定，可在高温下进行反应，该酶用于测序具有很好的链延伸性能，能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的影响。 （四）放射性核素标记的dNTP 一般采用α-32P-dNTP或α-35S-dNTP作为标记物。 （五）测序产物的凝胶电泳及识读 能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNA片段进行有效分离是序列分析成败的关键。 三、Sanger双脱氧链终止法的特点 1.快速简便，一次反应可测500个以上的碱基 序列。 2.荧光染料代替放射性核素标记，使该法便 于实现自动化分析，能够满足绝大多数DNA 样品序列分析的需要。 四、毛细管电泳 毛细管电泳（Capillary electrophoresis, CE）是以高压直流电场为驱动力，在毛细管内使荷电粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术。 具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化等优点。 常用于DNA测序的毛细管电泳形式有以下几种： （一）毛细管凝胶电泳 （二）非凝胶基质毛细管电泳 （三）阵列毛细管电泳 （一）毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳（Capillary gel electrophoresis, CGE）是将平板电泳的凝胶移到毛细管中做支持物进行电泳，由于电场强度比板凝胶电泳大大提高，使分离时间缩短约25倍。 DNA测序中凝胶毛细管电泳柱主要以聚丙烯酰胺凝胶作筛分介质，它黏度大、抗对流，能减少溶质的扩散，有极好的分离效果，除用于DNA序列分析外，还可用于DNA片段的分离和PCR产物的分析。 尽管CGE具有极好的分离效果，但存在一些问题，如制备凝胶柱费力，凝胶形成和电泳期间产生的气泡影响分离，使用过程中焦耳热对分离介质的降解使毛细管的寿命缩短等。 （二）非凝胶基质毛细管电泳 为了避免CGE存在的问题，非凝胶基质毛细管电泳用于DNA分析的研究越来越多，常见的有线性聚丙烯酰胺和纤维素衍生物等非凝胶基质，这些非凝胶基质在DNA测序中可以更换，使毛细管的寿命延迟，在优化条件下可获得高效及高速的分离效果。