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高效液相色谱仪操作方法 主讲人：马贵红 日期：2010-07-17 什么是高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种基于仪器方法的高效能分离手段： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器…… 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段 什么是高效液相色谱法 定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域 定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器 对定量及定性分析的要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用 高效液相色谱如何工作 一个储液瓶装有溶剂[称为流动相，因为溶剂是流动的]。 一个高压泵[溶剂传输系统或称溶剂管理器]用来产生和计量流动相的流速，一般是毫升/分钟。 一个进样器[样品管理器或自动进样器]可以将样品导入[注射]连续的流动相 ，并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。 色谱柱装有能获得分离效果的填料。这种填料称为固定相因为它被柱硬件包围住。 检测器用来查看化合物流出色谱柱时被分开的谱带[大多数化合物没有颜色，所以人眼观察不到]。 流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。 注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。 高效液相色谱如何工作 检测器连接计算机数据站，高效液相色谱系统单元先记录电信号，再将电信号转换为色谱图，在显示屏上展现出来。 定性和定量样品内溶物浓度。 由于样品中化合物性质差异很大，几种类型的检测器被开发出来。 如果一个化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收检测器。 如果这个化合物发荧光，可使用荧光检测器。 如果该化合物没有上述性质之一，可使用更广泛的检测器，如蒸发光散射检测器[ELSD]。 最强大的方式是顺序使用多个检测器。例如，紫外和/或蒸发光检测器可和质谱仪[MS]联用来分析色谱分离的组分。这样，从一次进样，可得到分析物的更多综合的信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之为液质联用. 液相色谱的各部分示意图 液相色谱实验所需的基本参数--亦称色谱条件 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法 仪器组成及开机 溶剂管理系统的准备 样品管理系统的准备 运行样品 数据采集 报告打印 关机 Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法 仪器组成及开机 1 仪器组成 Waters e2695 分离单元 2498型紫外检测器 色谱管理工作站 打印机  2 开机 打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。 溶剂管理系统的准备 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【 Menu/Status 】，进入“ Status （ 1 ）”屏幕 溶剂管理系统的准备 打开真空脱气机（degasser） Wet prime（执行湿灌注） 流动相平衡色谱柱 流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 流动相方面要求 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验） 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例 色谱柱的使用及操作 流动相的转换要缓慢 流速(压力)的变化幅度较小，比较稳定 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求 样品管理系统的准备 装载样品盘（loading carousels）： 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“ Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【 Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 样品方面要求 溶剂和样品过滤非常重要，