荧光定量pcr技术讲座理论基础引物及探针设计体系优化实验方案数据分析污染防控ppt课件.ppt

二、引物及Taqman探针的设计 2、Taqman探针及引物的设计原则： 在Taqman探针法中，Taq酶除了5’-3’聚合酶作用之外，还要5’-3’外切酶 的活性来切断探针链产生荧光，普通PCR的延伸温度为72℃，此温度为Taq 酶聚合作用的最佳温度；Taqman探针法反应中，在要求Taq酶5’-3’聚合酶活 性的同时，还需要Taq酶5’-3’外切酶的活性来切断探针链产生荧光，Taq酶 5’-3’外切酶活性的最佳温度为60℃，所以Taqman PCR反应的一般采用两步 法，即95℃变性，60℃复性延伸。 在Taqman探针及引物的设计过程中，引物的TM值已经确定为60℃左 右，在每轮PCR循环的复性过程中（95→60℃），为了确保探针先于引物与 模板结合，这就要求探针的TM值高于引物10℃左右，所以Taqman探针及引 物一般都是引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右。 二、引物及Taqman探针的设计 2、Taqman探针及引物的设计原则： （1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异； （2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显 子； （3）、引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右； （4）、探针的5’端应避免使用鸟嘌呤G，因为5’G会有淬灭作用，而且即使 是被切割下来还会存在淬灭作用； （5）、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量 G含量高会降低反应 效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针； （6）、引物之间的TM相差避免超过2℃； （7）、典型的引物长度为18-24bp，探针长度为15-45bp； （8）、PCR产物长度在50-150bp之间，这样有利于使PCR效率相同； （9）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其 特异性 二、引物及Taqman探针的设计 2、Taqman探针及引物的设计原则： 探针中GC含量的差异对定量PCR反应效率的影响 二、引物及Taqman探针的设计 3、Taqman探针及引物的设计举例 1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG 61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT 121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC 181 AGGGAGAAAG TGGTTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTA 241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATA ACAATCAGGA GGTAATTCCT 301 TATCATCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG 361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCA 421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA 481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC 541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA 601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT 661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT 721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC 经Oligo软件验证，探针TM值70℃左右，上下游引物的TM值都为60 ℃左右，二级结构 分析，引物和探针比较理想，再经BLAST分析，引物和探针特异性较好。 二、引物及Taqman探针的设计 4、Taqman探针及引物合成时注意事项 （1）、引物及探针设计好