第六章 微生物生态学的研究方法.ppt

第六章 微生物生态学的研究方法 1.直接测定法 利用光学和电子显微镜对样品中的微生物进行直接观察，并计算微生物数目或测定丝状微生物的长度，其结果可以用每单位面积或每单位体积或重量的微生物数目来表示，以此来估计生物量。 其优点是能够使人们直接观察到天然样品的微生物形态和微生物在自然样品所处的位置。 缺点是只能取少量的样品，与微生物所生活的整个自然环境相比，少量的样品不能代表整个自然环境。 2.培养法 培养微生物的方法是很多的，一般来说对所采集的样品应进行适当的稀释，以便每一个平板上只能生长有一定数目的微生物菌落。 其最大优点便是可以计算自然样品中的活微生物数目，并可以辨认真菌、放线菌和细菌。 其缺点是造成计算误差的因素很多。比如： A.自然中的许多微生物细胞成群粘接在一起，用普通的方法很难把它们分开，这样形成的菌落可能是由许多个细胞增殖而来的，而不是由单个细胞形成的菌落. B.有些微生物在平板上只能形成微菌落，不便于肉眼观察。 C.一般情况下实验室所用的培养条件很难满足所有微生物的生长，所用的有限种类的培养基也无法满足所有微生物的生长。 D.在平板上形成的丝状微生物菌落不知是从孢子而来的还是从菌丝而来的。 尽管如此，这种方法还是被广泛用于微生物生态学研究中，特别适合用于研究细菌生态学. 3.生理生化法 同位素示踪法。我们知道一个微生物群体的大小，那么通过测定H3标记的胸腺嘧啶组入微生物群体DNA中的速率便可以估计微生物的代时。 代谢活力测定法。是分析某些特殊酶类的酶活力，这一方法是假设所有待测的细胞都含有这些特殊的酶类，并且所有细胞以同样的能力使用这些酶类。 测定自然样品中的ATP含量也可以反映微生物代谢活力的大小和生物量的大小。 测定叶绿素的含量和其他光合色素的含量可以用来估计藻类和其他光合生物的生物量和代谢活力。 最广泛使用的测定代谢活力的方法是估计整个微生物群体的呼吸作用和藻类的光合作用，测定的对象是O2和CO2量的变化。 生理学的方法——Biolog 微孔板法 Biolog GN 板是一种多底物的96 孔ELISA 反应平板。除对照孔只装有四氮叠茂，其余95孔作为反应孔还装有不同的单一碳底物。在进行ELISA 反应时，各孔中的微生物利用碳底物，呼吸作用产生电子传递，引起四氮叠茂发生还原反应变为紫色。微生物对不同碳底物的利用情况可用发生反应的孔的分布及反应孔的颜色变化―― 时间关系即群落水平生理图谱（CLPP）来表示。通过对孔中颜色变化的光吸收值的测量，可获得较系统的信息。 Biolog 微孔板最初是由Biolog 公司为了鉴定纯种微生物而设计的，其碳源代谢指纹图可用来鉴定1900多种细菌、酵母和霉菌。1991 年，Garland 首次将Biolog 微孔板应用于土壤微生物群落的研究。现在Biolog 微孔板已被广泛应用于描述各种环境包括土壤、淡水、沉积物、活性污泥和海水的微生物群落生理状况。 4.数学模型法 研究微生物生态学过程中惯用的方法，是以感官观察为基础，经过一些实验将搜集的资料加以分析和解释，并进一步归纳、假设和推理。在这过程中，其结果大多数是描述性的，数据基本是孤立的。将数学研究应用于微生物生态学研究中，以统计数据和建立生态模型来定量描述微生物生态学问题。 首先在实验室中建立人工的经过简化的环境。 分解成许多小的、较为简单的亚系统。这些亚系统之间的相互作用，亚系统之内各种因素的作用则用数学方程式描述。可以大大地压缩真实过程的时间、人力和物力，并在短时间内调查生态演变过程的规律，并预测生态演变过程的发展趋势，提供最优利用方案。 第二节 微生物生态学的分子生物学研究方法 微生物分子生态学方法弥补了传统的微生物生态学方法的不足，使人们可以避开传统的分离培养过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构及其与环境的关系。 微生物生态学研究中采用的分子生物学方法主要有核酸探针技术、PCR扩增技术、rRNA序列同源性分析方法、梯度凝胶电泳方法等。 一、核酸探针杂交技术 核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列，并且用光密度测定法可直接比较核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。 其基本原理是:人工合成能与某类群微生物特征基因序列互补的寡聚DNA或RNA探针，并以荧光或放射性标记该探针，然后利用该探针与微生物基因杂交，通过荧光显微镜技术或放射自显影技术对微生物的群落结构进行分析和研究。 核酸探针杂交法的基本的步骤：先对rRNA(基因)序列比对，并对这些序列的特异性进行鉴定，然后进行互补核酸探针的合成和标记，最后对探针的特异性和测定敏感性进行评价和优化。 目前已经进行测序的核酸序列数目很有限，这样