乳酸菌镜检方法及显微镜使用方法.doc

乳酸菌精简方法及显微镜使用方法 第一部分：乳酸菌镜检可以采用革兰氏染色方法。 第二部分：使用显微镜的油镜进行镜检， 下面是具体的染色方法和镜检方法，请参考。 第一部分：乳酸菌革兰氏染色方法 目的 在乳酸菌发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的乳酸菌悬液或乳酸菌样品进行检测，观察乳酸菌乳酸菌在显微镜下的形态。 原理 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 3 实验用品准备： 灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器 4 操作： 1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 2 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。 4 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 5 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 6 媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 7 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 8 脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。 9 复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 10 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 11 干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。 清场 实验结束后，将显微镜油镜上的残留的香柏油用擦镜纸轻轻擦去，将载物台移至最底处，将灯光调到最暗并将其关闭电源，拔下电源插头，罩上防尘罩 第二部分 显微镜使用方法 以XSZ-3G型号的生物显微镜为例介绍显微镜操作规程及注意事项，乳酸菌形态观察要用油镜。 XSZ-3G生物显微镜操作规程及注意事项 1 操作规程 安放 右手握住镜臂，左手托住镜座，使镜体保持直立。桌面要清洁、平稳，要选择临窗或光线充足的地方，距离桌边3~4厘米处。 1.2 清洁 检查显微镜是否清洁，镜身机械部分可用干净软布擦拭。透镜要用擦镜纸擦拭，如有胶或粘污，可用少量二甲苯清洁之。 1.3 对光 镜筒升至距载物台1~2厘米处，低倍镜对准通光孔。调节光亮度的旋钮。 1.4 安装标本 将玻片放在载物台上，注意有盖玻片的一面一定朝上。用弹簧夹将玻片固定，转动平台移动器的旋钮，使要观察的材料对准通光孔中央。 1.5 调焦 调焦时，先旋转粗调焦旋钮慢慢降低镜筒，并从侧面仔细观察，直到物镜贴近玻片标本，然后左眼自目镜观察，左手旋转粗调焦旋钮抬升镜筒，直到看清标本物像时停止，再用细调焦旋钮回调清晰。 1.6 观察 镜检时应将标本按一定方向移动视野，直至整个标本观察完毕，以便不漏检，不重复。 低倍镜观察：观察任何标本时，都必须先使用低倍镜，因为其视野大，易发现目标和确定要观察的部位。 高倍镜观察：从低倍镜转至高倍时，只需略微调动细调焦旋钮，即可使物像清晰。使用高倍镜时切勿使用粗调焦旋钮，否则易压碎盖玻片并损伤镜头。 油镜的观察：先用低倍镜及高倍镜将被检物体移至视野中央后，再换油镜观察。油镜观察前，应将显微镜亮度调整至最亮，光圈完全打开。 使用油镜时，先在盖玻片上滴加一滴香柏油（镜油），然后降低镜筒并从侧面仔细观察，直到油镜浸入香柏油并贴近玻片标本，然后用目镜观察，并用细调焦旋钮抬升镜筒，直到看清标本的焦段时停止并调节清晰。 香柏油滴加要适量。油镜