申文娟生药1121五项目五.pptVIP

项目五 酶促转化产物L-丝氨酸的分析鉴定 任务1 酶促转化产物L-丝氨酸的分析鉴定 方案的制定 任务2 纸层析法分析鉴定L-丝氨酸 班级：生药1121 姓名：申文娟 学号：2011423215 组别：第五组 组员：申文娟 俞靖 贡静 顾海彬 杨恪鉴 蛋白质的组成单位-氨基酸 氨基酸结构通式 氨基酸（Amino acid）赋予蛋白质特定的分子结构 形态，使他的分子具有生化活性。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酵素和酶。 中文名称： 丝氨酸 英文名称： serine;Ser 定义：学名：2-氨基-3羟基丙酸。一种脂肪族极性α氨基酸。L-丝氨酸是组成蛋白质的常见20种氨基酸中的一种，是哺乳动物的非必需氨基酸，也是生酮氨基酸。在自然界中也有D-丝氨酸，如丝原蛋白中。在一些抗生素中也有D-丝氨酸。符号：S。 丝氨酸是一种非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着作用，因为它有助于免疫血球素和抗体的产生，维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。丝氨酸在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。 一、目的： 学习并掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的原理和方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维上吸附的水是固定相，展层用的有机溶剂是流动相。在层析时， 将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配。由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置，可用比移值（Rf）来表示。 所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值。如图 在一定条件下（如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变），某种物质的Rf 值是常数，因此可作为定性依据。 由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、试剂和器材： 1. 试剂： 1. 展层剂和平衡液 正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展层剂；下层液作平衡液(弃去)。 2. 样品液 用水配成每ml含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml的氨基酸溶液，以及上述四种氨基酸的混合液(各4mg/ml)。 3. 茚三酮 按展层剂0.25%的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解。 1.层析缸 2. 点样毛细管 3. 小烧杯 4. 培养皿 5. 量筒 6. 喷雾器 7. 吹风机（或烘箱） 8. 层析滤纸 9. 直尺及铅笔 1.准备滤纸：取宽约16cm、高约16cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处用铅笔划一直线A，在直线上做5个记号，记号之间间隔2cm，标出5个点，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位）。 2.点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。 3.层析：将平衡好的滤纸，放入层析缸底部接触展层剂液面，展层剂不可浸没样点，展层剂到达滤纸顶部边缘约0.5cm处停止层析（层析时间2h左右）。然后取出层析滤纸，标好前沿，放入烘箱中45℃烘干。 4．显色 用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可，滤纸上即显出紫红色或黄色的氨基酸斑点。 5．计算各种氨基酸的Rf值。 在操作过程中，手不要摸滤纸。 点样直径不超过3mm 。 点样的一端朝下, 扩展剂的液面需低于点样线1cm。 即时取出滤纸, 以免出现氨基酸层析跑到滤纸的外面不能检测。 ⑴层析纸上的样品斑点浸在展开剂中是否 可以？为什么？ ⑵悬挂层析纸为什么不能接触层析缸壁？ 不可以。因展开剂会稀释、溶解样品，或 使样品斑点严重扩散。 以免瓶壁上带有的展开剂或其他杂质影响 展开过程而使 值重现性不好。