现代生物学方法论课件1.ppt

　　根据酶活性部位柔性的基本理论，考虑RNA柔性比DNA大，设计一个以锤头核酶为催化结构域和以DNA为骨架的环状RNA-DNA酶。 Hammerhead ribozyme DNA 20 mer 随机DNA 体外筛选 5轮筛选 5’-ACA TGG CTA CCC AAG CAT GA-3’ cRDE Scheme for construction of circular RNA-DNA enzyme 环状核酶的构建 锤头核酶 单链DNA 10-23结构脱氧核酶 单链DNA载体M13mp18 5’-ACA TGG CTA CCC AAG CAT GA-3’ cRDE 环状RNA-DNA酶 可复制 的环状DNAzyme C-DZ482 　　以高活性、结构稳定的10-23 DNAzyme为催化中心，以单链载体M13mp18为骨架构建了环状可复制的10-23 DNAzyme 。 环状脱氧核酶的构建 以10-23 DNAzyme-hammerhead ribozyme 为催化中心，以单链载体pBlue script II KS (+)为骨架构建了复合酶DNAzyme-RNAzyme。 单链DNA载体M13mp18 10-23结构脱氧核酶 编码锤头核酶DNA 10-23结构脱氧核酶 单链DNA载体pBluescript II KS(+) Hammerhead ribozyme activity DNAzyme-RNAzyme 锤头核酶 单链DNA cRDE 10-23 DNAzyme activity Transcription in vitro “Translation” Replication pepzyme activity Circular DNAzymes 环状脱氧核酶-核酶复合酶的构建 核酶与脱氧核酶的转换 核酶与脱氧核酶的转换 conversion 双功能脱氧核酶的设计与构建 二 RNA干涉 (RNA interference,RNAi) 2.1 RNA 干涉现象的发现 1990 年，为加深矮牵牛花(petunias)的紫色，Jorgensen 等导入了一个强启动子控制的色素基因. 可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色. 这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen 把这个现象命名为共抑制(cosuppression)。 1995 年，康奈尔大学的Su Guo在用反义RNA(antisense RNA)阻断线虫基因表达的试验中发现， 反义RNA(antisense RNA) 和正义RNA(sense RNA)都阻断了基 因的表达。 1998 年，Andrew Fire 等的研究证明，在正义RNA 阻断 了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA，同时包 含了正义链和反义链的双链RNA (double-stranded RNA， dsRNA)阻断基因表达的效果要比单独注射正义链或者反义 链强得多。 1998 年2 月19 日 《自然》杂志(Nature) Fire 与 Mello 发现RNAi 的实验 带有肌肉蛋白编码信息的RNA 被注射到线虫(C. elegans) 体内. 单链RNA 没有产生任何效果. 但当双链RNA 注射之 后，线虫开始抽搐，这是一种类似于携带有肌肉蛋白缺陷 型基因的线虫所表现出的表型。 2006 年诺贝尔生理学或医学奖 Andrew Z. Fire Craig C. Mello 颁奖声明 获得者发现了一种可以针对特定基因降解其mRNA 的方式，在这种RNA 干涉现象中， 双链RNA(double-stranded RNA) 以一种非常明确的方式抑制了基因表达。植物、动物、人类都存在RNA 干涉现象，RNA 干涉对于基因表达的调控、对病毒感染的防护、控制跳跃基因具有重要的意义。 dsRNA的分子调控分类 mRNA降解 转录抑制 翻译抑制 染色体重构 2.2 RNAi的分子机制 RNAi的分子机制 RNAi的分子机制 2.2.1 dsRNA的产生 dsRNA 来源： 细胞内源性基因的双向表达 具有反向重复结构的细胞内源性基因表达形成的发夹状 RNA（shRNA) 转基因表达的mRNA 异常聚合 转座子转录 RNA病毒基因组或病毒感染复制过程中的中间RNA产物 实验方法通过质粒载体或病毒载体转染表达的dsRNA或shRNA 现代生物学方法论 吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室 核酸技术 盛永杰 　 核酸技术-用来研究核酸（DNA和RNA）的技术 纯化 定量 重量上的丰度：光谱定量 数量上的绝对丰度：定量PCR 高通量相对丰度：DNA芯片 高通量绝对丰度：序列分析基因表达（SAGE） 分子量大小：凝胶电泳