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蛋白纯化经验指南 推荐书籍：《蛋白纯化与实验鉴定指南》、《生物工程下游技术》、《酶工程》、《酶制剂工业》  1)  我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了 GST 亲和层析，之后用蛋 白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。 请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后， 融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用 GST做亲和层析，但效率只有 50～60  ％左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我 用 0.5％CHAPS 助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。 既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你也直 接加 2%的 PEG 这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了，我以前遇到这 样的蛋白是用 10%的乙醇加 3­5%的 PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高， 我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切 到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液 PH 值，看看改变它对溶 解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。  2)  请问楼主有没有合成过配体为 FMN 的亲和胶？ 亲和的填料合成过20来种,你是希望用它来纯化某种脱氢酶吗,我看FMN可偶联的有限,倒是  FAD 有活泼的氨基好偶联,何况它们几乎是同一个辅酶,你是不是考虑把 FAD 连上去.当然  FMN 的结构上也有个仲胺,可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上,而溴化氰活化或别的 活化的介质都不大好,因此我觉得这个没有什么问题.  此外如果是以 FMN 为辅酶的,那我还可以建议 你试试蓝色琼脂糖凝胶,因为它的配基的结构 和 FMN 的三个环很相似,它能纯化不少脱氢酶和激酶.如果它可以你就不需要合成填料了,有 现成的.  我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司 都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖 凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但 是如果是小分子的配基最好选择有 3­10 碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报 导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择 自己适合的活化介质。 不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求， 所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选 择合适的活化介质。 我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶， 它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以， 而 且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳 定，配基脱落少。我觉得是不错的选择。 包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说 在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释 复性,包括国外的专家也这么说.我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常 改变条件. 层析复性很时髦,但是真正能用的不很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关 键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。  3)  Sephadex G­25 （medium）柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗？若有，一般对盐 浓度限度如何？ 大家别客气， 除盐对于浓度应该也是有一定的限制的，同样的样品盐浓度高的自然要比浓度 低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，但是在正常的范围如  1­2M 应该影响不大，不过要除得很干净还是尽量少上点样品，我觉得上样的体积毕竟比浓 度的影响更大。  4)  我的蛋白 17kd 左右，能跟肝素亲和，一般用离子交换和亲和层析纯化， 现在我用聚乙二醇修饰它 ，分子量增加 5000 左右，修饰率不可能达到 100％，请问 修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开？（当然修饰后还残留有聚乙 二醇，这个小分子也要除掉） 他们大多用凝胶过滤，我觉得这也不错的做法，毕竟 PEG 是链状的分子，在柱子上和普通 蛋白行为不一样，修饰度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白选择 sephadex G50 试试，它 的范围在 1000­30000，应该是不错的选择。此外 PEG 是个疏水性的链，修饰后的蛋白疏水