鼠疫实验室检测技术.ppt

鼠疫实验室检测技术 鼠疫实验室检测 针对病原体本身的生长繁殖、生理生化特性的检测：鼠疫菌的染色检查；鼠疫菌的培养及鼠疫噬菌体试验；鼠疫菌的生化检查、营养需求、毒素检测、毒力测定等。 针对病原体特异性抗原结构的检测：鼠疫F1抗原抗体检测；鼠疫菌外膜蛋白的检测。 针对病原体遗传基因的检测：鼠疫菌的质粒检测；鼠疫菌特异性核酸片断的检测；鼠疫菌全基因组测定；插入序列的检测。 一、鼠疫菌菌体形态检查 典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长1~2μm，宽0.5~0.7μm,中段膨大，两端钝圆，且两极浓染的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。革兰氏染色阴性。 染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压印片，可见到两端钝圆、两极浓染的典型鼠疫菌。压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌，对于鉴别杂菌污染材料极有价值。 鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红色）、美兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明显）、姬姆萨染色（菌体染成色，荚膜染成色） 鼠疫菌染色检查(脏器压印片) 革兰氏染色 美兰染色 鼠疫菌染色 鼠疫菌涂片的革兰氏染色 鼠疫菌染色检查 Wayson stain(魏申氏染色)呈现的两极浓染特征 荚膜染色—墨汁负染色 二、鼠疫菌的培养特性 鼠疫菌是典型的异养菌。 鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。 鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为28℃，最适pH为6.9-7.1，发育初期的最适氧化还原电位（Eh）约为100~150mV，接种后至少20h以上才能形成肉眼可见的菌落，一般24~48h形成肉眼可见的小菌落。 强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。37℃缺钙条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量Yops,表现很强的表达和分泌毒力蛋白V抗原（LcrV）。此现象称为低钙反应，受70kb(45MD)质粒上的遗传基因控制。 典型鼠疫菌培养18-20h光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养24h以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色，反射光线下菌落圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗，有黄褐色粗糙颗粒，周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、薄而透明的花边。 鼠疫噬菌体试验 在培基上密集平行划线培养鼠疫菌，鼠疫噬菌体滴于上端划线中部，直立平板，使噬菌体液垂直划线自然流下，置20℃培养24h,有明显的噬菌带。 在18~22℃鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫菌而不裂解假结核菌，具有较强的专一性(噬菌作用具有种的特异性)，是鼠疫细菌学诊断中特异的鉴定方法之一。 鼠疫噬菌体试验可快速诊断鼠疫菌。对被检材料作细菌分离培养的同时作噬菌体裂解试验，20h左右即可获得结果。 分离到鼠疫噬菌体，可以间接判定检材中存在鼠疫菌。 鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验 典型鼠疫菌菌落形态 噬菌带 鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验 鼠疫菌培养特征 鼠疫噬菌体试验 三、鼠疫F1抗原、抗体检测 鼠疫F1抗原检测 1.反向血球凝集试验(RIHA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 3.胶体金免疫层析法(GICA) 4.免疫荧光技术(IFT) 鼠疫F1抗体检测 1.间接血球凝集试验(IHA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 3.胶体金免疫层析法(GICA) 间接红血球凝集试验(IHA) 鼠疫菌特异性F1抗原致敏经单宁酸鞣化处理的醛化绵羊红血球，制备成F1抗原致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗体。试验方法和结果判定均为常规操作。 IHA微量法结果： 反向血球凝集试验(RIHA) 用F1抗体致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗原。试验方法和结果判定与IHA相同。 RIHA微量法结果： 酶联免疫吸附试验(ELISA) 测抗体. 双抗原夹心法：F1抗原包被反应板，加入待测标本28℃反应1.5h洗板，加入HRP-F1抗原28℃反应1h洗板，加入底物OPD蔽光反应30min后加终止液(2mol/L硫酸)。 间接法： 已知F1抗原包被反应板，加标本37℃反应1h洗板，加入酶标二抗37℃反应1h洗板，加入底物(如OPD或TMB)蔽光反应30min显色后加终止液。 用肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的吸光度值(A) 测抗原 双单抗夹心法： F1-McAb包被反应板，加入标本28℃反应1.5h洗板，加入HRP-F1McAb 28℃反应1h洗板，加入底物OPD蔽光反应30min后加终止液。 双抗体夹心法(改良法-美国CDC鼠疫诊断技术实验室操作手册)：鼠疫免疫血清特异性抗体( F1Ab)包被反应板，加标本37℃反应1h洗板，加小鼠F1McAb 液37℃静置1h洗板，加HRP标记的羊抗小鼠IgG 37℃反应1h洗板,加底物OPD蔽光反应30min显色，加终止液。 肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的吸光度值(A) 胶体金免疫层析法(GICA) 检测鼠疫菌特异性抗原、抗体的金标技术以GICA广泛用于实践。基本原理均