第5章 分子生物学基本研究方法6-RT-PCR.pptVIP

分子生物学与基因工程 第五章 分子生物学基本技术5-RtPCR 西北师范大学 武国凡 分子生物学与基因工程 第五章 分子生物学基本技术5-RtPCR 西北师范大学 精品课程 武国凡 实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用 定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 原理 常 规 PCR技术： 对PCR的终产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应进行实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR-定量原理 实时荧光定量PCR三个重要概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 扩增曲线 荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光阈值的默认设置：是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值 Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value Ct值的重现性 横轴：PCR反映循环数 纵轴：荧光信号量 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 定量原理 理想的PCR反应： X=X02n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 标准曲线 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 Sample 实时荧光定量PCR原理 绝对定量 25 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 实时荧光定量PCR 原理 --- DNA 产物的荧光标记 方法 1--- SYBR Green 法---机理 SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光。 5’ 3’ 5’ 3’ SG No Emission SG SG SG SG SG SG SG SG SG SG 5’ 3’ 5’ 3’ Emission Emission SYBR Green I 熔解曲线分析 温度 荧光强度 Tm Tm值：DNA解链一半时的温度 将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT) -dI dT Tm 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 非特异性产物 Cycle number Flourescenc Ck 102 Ck 104 Sample Cycle number Log of DNA concentration SYBR Green 法---定量原理 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 SYBR Green 法 --PCR反应的建立 反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 Mg