第四章植物原生质体培养及细胞融合.pptVIP

原生质体培养与细胞融合 第一节 原生质体培养 一、 原生质体的培养概况 1、概念： 植物的原生质体(Protoplast)指除去细胞壁以后的裸露细胞。 原生质体培养（Protoplast culture）是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完整植株的过程。 原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。 原生质培养首先在烟草上获得成功NagataTakebe（1971），到1993 有49个科，146个属的320多种植物培养成功，得到再生植株。 2、原生质体培养的意义 ① 比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采用细胞遗传工程的方法培育出新品种。 ② 便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本科植物，高光效植物，高抗植物） ③ 原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等 3、原生质体培养程序 取材→预处理→分离→纯化→活力检测→培养→细胞壁再生→细胞分裂分化→愈伤组织→愈伤分化→再生植株 取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、愈伤组织或悬浮细胞 预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。 二、原生质体的分离和纯化 1 原生质体的分离 叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。 细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。 分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法 （1）机械法： ①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状； ②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。 最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。 缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。 一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。 但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用（优点）。 （2）酶解法 采用多糖水解酶将细胞壁降解而获得原生质的一种方法。 常用于降解细胞壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶和胼胝质酶（成熟花粉粒、四分体小孢子）等。 1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。 步骤：取材→预处理→酶液配制（过滤灭菌，包含果胶酶和纤维素酶及渗透调节剂和质膜稳定剂） →酶处理(10ml/g，抽真空，摇床，40r/s，26℃ 2～8h) →过滤离心。 优点：可以获得大量的原生质体，适用于几乎所有植物和器 官，双子叶植物叶肉细胞比单子叶更易分离。 缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶及酚类物 质，会影响原生质体的活力。 2 影响原生质体数量与活力的因素 光:一般在黑暗静止条件下进行. 温度:酶解温度25-30℃,兼顾原生质稳定性及酶活性. 时间:几小时到几十小时,太长影响原生质活力,一般小于24小时,如烟草叶片保温24小时叶肉细胞解离完毕. 细胞壁降解酶的种类和组合:一般植物细胞使用(纤维素酶0.7-1%,果胶酶0.5-1%),花粉细胞和四分体小孢子,可使用蜗牛酶和胼胝质酶。 渗透压的稳定剂种类:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等，如甘露醇一般为0.5-0.7M。 原生质膜稳定剂 (CaCl2：0.1mM,葡聚糖硫酸钾 0.2-0.3%；葡聚糖硫酸钾0.2%-0.3%) pH影响 5.4-6.0 3 原生质体的纯化（净化） 指将酶解后的溶液中的原生质体与组织残渣（如去未脱壁的细胞、细胞碎片）分开的过程。 (1) 沉降法 原理：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中进行过滤离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。 过程：首先将含有原生质体与酶混合液过网筛（44～169μm孔径），除去叶脉大组织块。然后低速离心（900～4500r/min）收集沉于底部的完整的原生质体。 一般叶肉原生质体均采用沉降法，优点是采集方便，缺点是不能完全除去少量的细胞和破碎的原生质体。 (2) 悬浮法（漂浮法） 原理：采用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后，使原生质体漂浮于溶液表面，而残渣碎屑沉淀于底部。 过程：加0.5M蔗糖溶液，原生质体浮于表面，取出浮于表面的原生质体，反复操作。 这种方法可收