Bradford法测蛋白质浓度.pdf

Bradford 法测蛋白质浓度 一、实验原理 考马斯亮蓝 （CBB ）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在 游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm ；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白 质—色素结合物在 595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正 比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min 左右的时 间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法试 剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比 Lowry 法还高 4 倍，可 测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml ，是一种常用的 微量蛋白质快速测定方法。 二、试剂配制 10ml 标准蛋白溶液 浓度： 1mg/ml 牛血清蛋白 配置： 用十万分之一天平称取0.01g 牛血清蛋白(98%)倒入10ml 容量瓶中， 用0.15M NaCl 溶液定容至 10ml，室温下充分混合溶解1 小时，10000rpm 离心 半分钟，取上清液。 500mL 染色剂 浓度： 0.01% （w/v ）G250，8.5%磷酸和4.75% 乙醇 配置： 用千分之一天平称取0.05g G250 于烧杯中，加入25mL 95%乙醇， 使用搅拌子搅拌，再量取50mL 85%的磷酸溶液，最后去离子水定容至500mL 。 配好后用Whatman1 号滤纸过滤。 保存： 在常温条件保存在棕色试剂瓶中三个月，但这段时间可能会出现染料的 沉淀，所以每次使用前需混合均匀。 二、保存条件 保存： 在常温条件保存在棕色试剂瓶中三个月，但这段时间可能会出现染料的 沉淀，所以每次使用前需混合均匀。 三、实验过程 1. 提前至少半小时打开紫外分光光度计或者酶标仪 2. 配制蛋白标准溶液 先配制1 mg/ml 的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶 液（PBS）配制一组浓度分别为1.0mg/ml ，0.8mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml ， 0.1mg/ml 的BSA 溶液100μL，计算稀释各组需要的BSA 溶液及PBS 溶液的体积。 BSA 体积 0 10 20 40 60 80 100 （ul ） PBS 体积 100 90 80 60 40 20 0 （ul ） BSA 浓度 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （mg/ml ） 3. 将配置好的不同浓度蛋白标准溶液30μL加到1mL Bradford工作液中，轻轻 颠倒混匀，静止5min 。 4. 将适量体积的样品用PBS稀释至30mL，加入1mL Bradford工作液中，轻轻 颠倒混匀，静止5min 。 注：样品稀释倍数需要根据原始样品的浓度进行适量调整，一般保证稀释 后样品浓度在0.1-1.0mg/ml，所以测浓度之间可以简单的估计一下浓度范 围，一般情况需要稀释10左右。 5. 将反应好的溶液300μL加入到96孔板的样品孔中。 6. 使用紫外分光光度计或酶标仪测定A595nm吸光度。根据标准曲线计算出 样品的蛋白浓度。 四、实验数据及处理 测得三次重复实验BSA 溶液的吸光度如下： 编号 吸光度1 吸光度2 吸光度3 平均吸光度 浓度(mg/mL) 1 0.000 0.000 0.000 0.000 0.00 2 0.127 0.124 0.126 0.126 0.10 3 0.245 0.242 0.248 0.245 0.20