枯草芽孢杆菌产肌苷的发酵过程优化及其 代谢机理分析-微生物学专业毕业论文.docx

万方数据 万方数据 集 美 大 学 硕 士 学 位 论 文 枯 草 芽 孢 杆 菌 产 肌 苷 的 发 酵 过 程 优 化 及 其 代 谢 机 理 分 析 杨 哲 1 万方数据 万方数据 学术诚信声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究 工作及取得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成 果。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人(签名)： 时 间： 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文。同意集美大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 作 者(签名)： 导 师(签名)： 时间： 2 枯草芽孢杆菌产肌苷的发酵过程优化及其代谢机理分析 摘 要 肌苷在食品、药品和临床医疗等领域都有非常重要的用途。近年来，随着国外厂家 对中国市场的冲击，国内的核苷发酵产业面临着严峻的挑战。因此，本论文以本实验室 选育得到的一株肌苷生产菌株枯草芽孢杆菌 JMUKC2 为研究对象，以肌苷产量为主要指 标，利用响应面分析 、均匀设计、代谢通量 分析、半定量 PCR 方法对其在发酵 生产肌 苷的发酵过程优化及其代谢机理分析，以期提高肌苷的发酵得率、降低其生产成本。 (1)进行了发酵培养 基和培养 条件优化 。首 先通过单因素 方法考察 了发酵条 件对 JMUKC2 发酵产肌苷的影响 ，得到最佳的摇瓶发酵生产条件。接着利用 Plackett-Burman 对众多因素进行了分析，结果表明葡萄糖浓度、玉米浆浓度、装液量、接种量 4 个因子对 肌苷产量影响显著。最后对 4 个 影响因子 进行 最陡爬坡试验和响应面试验。在得到的最 优条件下 进行发酵生产肌苷，肌苷产量达到 8.28 g/L，较优化前提高了 49.9%。 (2)考察促进剂对肌苷产量影响。基于促进剂单独添加对 CICC20958 和 JMUKC2 菌株 生产肌苷的影响，采用均匀设计法得到最佳组合添加方案。结果表明，CICC20958 菌株 在添加柠檬酸钠 7.9 g/L、NaF 0.001 g/L、CaCl2 0.032 g/L、次黄嘌呤 2.1 g/L、MnSO4 0.2 g/L 下发酵，肌苷产量达到 7.81 g/L，比空白提高 538%；JMUKC2 菌株在柠檬酸钠 5.2 g/L、NaF 0.001 g/L、葡萄糖酸钙 12 g/L、次黄嘌呤 4.5 g/L、MnSO4 0.19 g/L 下发酵，肌 苷产量为 13.94 g/L，为空白组的 2.52 倍。 (3)对 CICC20958、JMUKC2、JMUYS、JMUhp 菌株生产肌苷进行代谢通量分析。结 果表明经诱变得到的三株菌(JMUKC2、JMUYS、JMUhp 菌株)葡萄糖分解途径的代谢通 量明显增大，流入肌苷合成途径的代谢流比例更高；其次，采用半定量 PCR 方法对枯草 芽孢杆菌肌苷生产过程中的五种关键酶基因表达水平进行分析。从结果可以发现，磷酸 果糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的高表达可以增强相应酶促反应速率，影响肌苷发 酵过程的代谢流分布。 关键词 枯草芽孢杆菌，肌苷，摇瓶发酵，代谢通量分析，半定量 PCR I Optimization of Inosine Fermentation Process and Analysis of Metabolic Mechanism by Bacillus subtilis Abstract As a typical primary metabolic, inosine is widely used in pharmaceutical, medical and food industries. For the past few years, domestic inosine fermentation industry was facing severe challenges with impact of foreign manufacturers. In order to increase its inosine production, the technology of shaking-flask fermentation was optimized by response surface methodology addly the best compound plan of adding accelerators was obtained by uniform design to increase inosi