蛋白质的离子交换层析技术研究进展.ppt

5.常见问题及处理 层析速度太慢 5.1 蛋白质不与树脂结合 5.2 纯化蛋白质的产率低 5.3 蛋白质分辨效果差 5.4 增加柱压并轻敲柱壁的方法以除去气泡，确保在引入任何溶液时不要产生气泡 样品蛋白质损失量允许的情况下，支撑物应取出并清洗 用高径比较小的柱子 过柱前的样品要超声或超滤处理 产生气泡 树脂基质发生粘连 层析柱太细 细小颗粒堵柱 5.1层析速度太慢 问题 处理 降低初始上样缓冲液离子强度 注意计算蛋白质的等电点 树脂应充分平衡或用严格的再生方法 初始上样缓冲液离子强度过大 树脂pH值因解吸作用而发生变化 树脂未进行适当平衡或再生的树脂未洗净 5.2蛋白质不与树脂结合 问题 处理 树脂上的蛋白质未洗净 pH值不合适或蛋白质发生沉淀 水解酶破坏了目的蛋白或树脂中有微生物滋生 5.3纯化蛋白质的产率低 增强溶液离子强度；更换活性高的反离子或使用去垢剂等方法解决。 适当调节PH 蛋白提取过程中应加水解酶抑制剂抑制蛋白水解 问题 处理 5.4蛋白质分辨效果差 流速太快或层析柱过短 梯度洗脱时洗脱液浓度变化太快 上柱蛋白质过多 降低流速 可采用连续洗脱等梯度变化较慢的洗脱 减少上样量 问题 处理 6.应用实例 混合物的分离 6.1 蛋白质的柱上复性 6.2 6.1混合物的分离 Bio-Rex70层析分离眼镜蛇神经毒素的6种单乙酰基衍生物 眼镜蛇神经毒素，一种小分子碱性蛋白，分子中6个氨基（5个侧链Lys残基和一个游离的N端氨基）均能被乙酰化生成乙酰基衍生物,形成的6种单乙酰基衍生物中净电荷数相同，但表面的电荷分布不同。据此，可以用Bio-Rex70将它们分开。 6.1混合物的分离 两步连续离子交换制备色谱分离纯化PEG-rhG-SCF 蛋白质聚乙二醇化的反应，生成非PEG化蛋白和不同程度的PEG化蛋白的混合物。因蛋白质PEG化程度越高，其等电点越低，根据电荷量的差异，通过SP-SepharoseFF和SOURSE Q30作为阳、阴离子色谱连续两步将之分离开来。 6.1混合物的分离 蛋白质PEG化程度越高，其等电点越低。 在阳离子交换色谱，PEG化蛋白与介质结合较弱，主要出现在流穿峰中，通过洗脱液将非PEG化蛋白洗脱下来。而在阴离子交换色谱中，由于PEG的“屏蔽效应”阻碍了蛋白与交换剂间的作用，PEG化程度高的蛋白反而易被洗脱。 SP-SepharoseFF分离聚乙二醇化的rhG-CSF和未反应的rhG-CSF SOURSE Q30阴离子交换色谱分离不同的修饰组分 峰3，2，1分别代表单、双、三聚乙二醇化蛋白 6.2包涵体蛋白的柱上复性 吸附：用变性缓冲液溶解蛋白，用变性缓冲液平衡色谱柱，使伸展的变性蛋白吸附到介质表面。色谱柱有效分隔蛋白质分子，抑制分子间的聚集。 复性：复性缓冲液相对于变性缓冲液，只少变性剂，其它成分都一样。变性剂的线性减少能有效抑制复性聚集体的形成，且利于蛋白在柱上的自发折叠。 洗脱：用含高浓度盐的洗脱缓冲液，洗脱折叠后的蛋白。 6.2包涵体蛋白的柱上复性 离子交换层析复性rh-IFNγ折叠二聚体 ①A液（6M Urea，50mM PBS，pH7.0）溶解变性的包涵体蛋白，并用A液平衡SP-SepharoseFF柱。此时，由于高浓度的变性剂的存在，使rh-IFNγ去折叠并吸附到柱上，单个蛋白彼此分开。 ②B1液（50mM PBS，pH7.0）和A液混合过柱，形成线性减少的尿素浓度梯度，以诱使吸附在柱上的蛋白复性，同时减少复性中间体的聚集。 ③B2液（1M NaCl，50mM PBS，pH7.0）将复性后的蛋白洗脱下来。 复性后的rh-IFNγ的纯度达 95 % , 蛋白收率达 54 % , 比活为 7.5 × 105 IU /mg-1 Thanks for attention 相比于无机离子，蛋白质具有其复杂性：①蛋白质是两性离子，不同的pH下，蛋白质会带有不同符号及数目的电荷。②除了静电力以外，蛋白质还和交换剂间形成氢键、疏水作用、范德华力等多种弱作用力。③蛋白质是大分子，有多个吸附位点。是多点吸附。④蛋白质的体积大，扩散速率慢，使得其在离子交换的基础上，兼有分子筛效应。 * 离子交换剂由3部分组成：水不溶性基质、活性基团、平衡离子。 作为基质，首先要具备机械稳定性强，化学稳定性好，颗粒均匀等性质。 同时，由于基质和蛋白质分子间可能因疏水作用而吸附过牢，导致不易洗脱，甚至使蛋白变性，所以基质还应有一定的亲水性。 作为大分子，蛋白质与介质之间，除了有静电引力以外，还兼有分子筛效应。 最重要的是交换容量。 实际交换容量指每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量，其数值大小取决于离子交