课件：蛋白质和氨基酸测定学时资料.ppt

C、测定 C8或C18柱 流动相：柠檬酸、辛烷磺酸钠、乙腈组成 流速1mL/min，柱温40℃，进样量20μL 波长240nm 。 * 二、分光光度法 方法 原理 紫外吸收法 蛋白质在280nm处有吸收。 考马斯亮蓝比色法 考马斯亮蓝使蛋白质染色，在620nm处有最大吸收（标准物质：牛血清蛋白bovine serum albumin）。 双缩脲法 双缩脲与碱性铜生成紫红色配合物，在560nm处有最大吸收。（备注1） lowry法 蛋白质-铜络合物中的酪氨酸及色氨酸残基使磷钼酸-磷钨酸（Folin phenol reagent）还原成蓝色物质。（备注2） * 备注1： * 双缩脲法 备注2： （1）lowry法的原理 色泽的变化主要缘于钼、钨化学价的降低，该物质的吸收波长在550-750nm之间，当蛋白质浓度在1-100μg/ml时，用750nm或660nm，当蛋白质含量更高时，用550nm。 没有铜离子时，色泽由蛋白质中的酪氨酸及色氨酸残基含量决定，其次是半胱氨酸和组氨酸残基含量决定，铜离子将肽键聚合在一起，从而加速了电子的传递。 干扰物质较多：柠檬酸，tris，甘氨酸，组氨酸，谷氨酸，EDTA，葡萄糖，果糖，高浓度的尿素，硫酸铵等都有影响。 * （2）试剂组成（/hansen/protocols/lowry.htm） Lowry A: 2% Na2CO3 in 0.1 M NaOH Lowry B: 1% CuSO4 in diH2O Lowry C: 2% sodium potassium tartrate (NaKC4H4O6? 4H2O) Lowry stock reagent 49 ml Lowry A 0.5 ml Lowry B 0.5 ml Lowry C Folins Reagent: Phenol reagent - 2N (Folin - Ciocalteau reagent) 主要成分为：3H2O?P2O5?13WO3?5MoO3?10H2O 3H2OxP2O5?14WO3?4MoO3?10H2O （ /wiki/Folin%E2%80%93Ciocalteu_reagent ） Folin phenol试剂还可以测定酚类物质的含量（郑鸿元 许光辉 李凤珍等 .土壤微生物分析方法手册. 中国农业出版社，1986.） * （3）该法的历史 吴宪博士[（1893—1959年）是国际著名生物化学家、中国近代生物化学事业的开拓者和奠基人]于1922年发现Folin phenol reagent能测定蛋白质 (Wu, H. (1922) J. Biol. Chem. 51, 33–39) 。 Lowry发现，在此前，先让蛋白质与铜发生发生络合反应（双缩脲法 ），能提高反应的灵敏度(Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J.(1951) J. Biol. Chem. 193, 265–275）。 * THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 第二节 蛋白质定性（略） 　定性蛋白质主要是通过显色反应完成。 常用显色剂：氨基黑10B、溴酚蓝、考马斯亮蓝、酸性品红、氨基萘酚磺酸。 另外对于糖蛋白及脂蛋白都有专门的显色剂。 * 第三节 氨基酸定性 一、一般显色反应　　茚三酮法：蓝紫色。 二、个别氨基酸的显色反应（略） 　　　精氨酸的坂口反应、胱氨酸和半胱氨酸的显色反应等。 * 第四节 氨基酸定量 一、甲醛滴定法 1、原理 酸性的-COOH，碱性的-NH2，使氨基酸成为中性的内盐，加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，用碱滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量。 2、大约过程 加碱中和酸（pH 8.2）、加入甲醛，加碱滴定。当加入甲醛后，溶液的pH值还在8.2吗？当样品中存在ＮＨ4+时, 则测定结果偏大偏小？如何排除这种影响？ * 阮富升. 铵盐对甲醛法测定酱油氨基氮含量的影响. 中国调味品. 第8期1999年8月. 甲醛不但与氨基酸的氨基起反应,同时也与ＮＨ4+起反应，增 加了反应体系的酸性，这部分酸性不能代表氨基酸的羧基的酸性。 因此，以氢氧化钠标准溶液滴定时，会消耗更多的氢氧化钠标准 溶液，使氨基氮计算结果升高。 4NH4++ 6HCHO =(CH2）6N4 H+ + 3H+ + 6H2O * 二、