产绿原酸金银花内生菌的分离研究论文.doc

摘要 目的：通过对金银花不同组织器官内生真菌的分离，筛选能产生绿原酸的菌株，通过菌株的筛选及培养条件的优化，获得高产绿原酸的发酵菌株及培养基和培养条件。 方法：从金银花不同组织器官中分离内生真菌，通过分离纯化、发酵，对其发酵产物进行TLC和HPLC分析，同时利用显微观察法对其进行显微鉴定，对筛选的高产绿原酸菌株的发酵培养基和培养条件进行优化选择，并对菌株发酵液进行抑菌学实验。 结果：从金银花中分离筛选到三株纯化的的内生真菌，其浓缩发酵液与对照品有相同的迁移率，保留时间与对照品保留时间一致，结果表明，三株纯化获得的内生真菌能产生绿原酸，分别属于青霉属、毛霉属、曲霉属。经过发酵条件的优化，确定最佳发酵培养基为PDB培养基，培养条件为28℃,120r/min，震荡培养72小时 结论：金银花不同器官中具有丰富的内生真菌，并有可能产生与宿主相同的活性成分绿原酸，纯化的产绿原酸菌株的发酵液具有明显的与金银花相同的抑菌效果。 [关键词]：金银花；内生真菌；绿原酸；发酵 缩写词表 TLC thin layer chromatography 薄层色谱 HPLC high performance liquid chromatography 高效液相色谱 PDA potato-dextrose-agar medium 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 PDB potato-dextrose broth 马铃薯葡萄糖培养基 目录 TOC \o 1-3 \h \z \u 1 前言 h 4 1.1 内生菌与植物的关系 h 4 1.2 内生菌天然药物新资源及其展望 h 5 2 问题的提出 h 6 3 材料与方法 h 7 3.1试剂 h 7 3.2 实验方法 h 8 3.2.1 菌株的筛选 h 8 3.2.1.1 实验材料的采集 h 8 3.2.1.2 样品的消毒处理 h 9 3.2.1.3 表面消毒效果的检测 h 9 3.2.1.4 分离与纯化 h 9 3.2.1.5 菌种的保藏 h 10 3.2.2 菌株次生代谢产物检测 h 10 3.2.2.1 菌株的小样培养 h 10 3.2.2.2内生菌发酵液的提取处理 h 10 3.2.2.3 薄层色谱法(TLC)检测绿原酸 h 11 3.2.2.4 高效液相色谱法(HPLC)检测绿原酸 h 11 3.2.3 内生真菌的形态学鉴定 h 11 3.2.4 二次发酵培养基的优化 h 12 3.2.4.1 固体基本培养基的选择 h 12 3.2.4.2 液体基本培养基的选择 h 12 3.2.4.3 发酵条件的单因素优化 h 13 3.2.4.4 发酵条件的正交试验 h 13 3.2.5 金银花内生真菌的抑菌实验 h 14 4 结果与分析 h 15 4.1 菌株筛选的结果 h 15 4.2 菌株次生代谢产物检测结果 h 15 4.2.1 薄层色谱法(TLC)检测 h 15 4.2.2 高效液相色谱法(HPLC)检测 h 16 4.3 内生真菌的形态学鉴定结果 19 4.3.1 传统鉴定方法 19 4.3.1.1 菌株形态学描述 19 4.3.1.2 显微形态鉴定 h 21 4.4 二次发酵条件的优化结果 h 25 4.4.1 固体基本培养基的选择结果 h 25 4.4.2 液体基本培养基的选择 h 25 4.4.3 纯化分离出的菌株发酵液形态 h 27 4.4.4 发酵条件的单因素比较 h 29 4.4.4.1 碳源的选择 h 30 4.4.4.2 氮源的选择 h 30 4.4.4.3 温度的选择 h 31 4.4.5发酵条件的正交试验 h 32 4.5 抑菌实验结果 h 34 5 结论与讨论 h 35 6 展望 h 36 参考文献 h 37 1 前言 1.1 内生菌与植物的关系 内生菌(endophyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。内生菌也可理解为植物组织内的正常菌群，它们与植物的关系相当密切，是植物微生态系统的天然组成成分。关于内生菌的起源仍然有不同的观点，存在两种假说，即“内生说”和“外生说”:内生说认为内生菌与宿主植物应该具有相同或相似的遗传背景；外生说认为内生菌源于植物体外，通过植物体表、根际的自然孔口、伤口或诱导植物形成的通道进入体内。 内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，植物以其内生菌的组织、细胞及其代谢产物为内环境，而内生菌以宿主植物的组织和细胞及其