质粒DNA测定生化实验报告.doc

南方医科丈修 生物化学实验报告 姓 名： 杨晓霞 学 号 3120040025 专业年级： 2012级口腔 组 另IJ: 第一实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 (Title of Experimetn) 质粒0珈曲提取、定量、 酶切坊C氏鉴定 实验日期 2013-11-22 实验地点第一实验室 (Date of (Lab No.) Experiment) 合作者 黄芜 指导老师周珏宇 (Partner) (Instructor) 总分 教师签名 批改日期 (Tota1 Score) (Signature) (Date) 【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主 要试剂、主要仪器与器材）.③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分 （满分30分） \XX\ 一、实验原理： PCR :即聚合酶链式反应。是指在DNA聚合酶催化下，按照半保留复制的机制以DNA 为模板，特定引物为延伸起点，dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外 （缓冲液中）复制DNA ,使目的DNA按2方式呈指数级递增的过程。 a .变性：加热反应系统至90。0959 ,使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。 火：降低溶液温度，使合成引物在低温（35?7CTC,—般低于模板Tm值的5七左 右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 C?延伸：溶液反应温度升至中温72°C ,在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为 复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 质粒DNA的提取与制备: a?碱裂解法：根据染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异，在高碱性条件下， 染色体DNA和质粒DNA变性，当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，染色体DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起成为沉淀，而 变性的质粒DNA复性并保存在溶液中。 b .离心层析柱：首先，硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA ,不吸附蛋白质、多糖等物质；然后，通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成 分去除；最后，低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 质粒DNA的定量（紫外分光光度法）：由于物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 和物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。DNA 分子中由于碱基上存在共辄体系，对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰且吸收强度 与溶液中DNA的浓度成正比。 质粒DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限 制性内切酶能特异性地结合于一段被称之为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其 附近的特异位点上，并在此切割双链DNAo分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别 位点长度为4、5或6个核苜酸的反向重复序列。 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝 胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。而DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。由于电荷效应与分子筛效应，不同的DNA分子在琼脂糖凝胶中泳 动时，因其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分岀不同的区带。其 中，DNA迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 二、实验材料 实验样品：PCR :菌液 质粒DNA的提取与制备：含 质粒DNA的提取与制备：含pMD18-T质粒的大肠杆 DH5a 质粒DNA的定量：提取的质粒DNA溶液 质粒DNA的酶切鉴定：大肠杆 质粒DNA的酶切鉴定：大肠杆 DH5a菌株（含靶基因CHD5片段的 pMD19-T) 琼脂糖凝胶电泳：提取的质粒DNA溶液、PCR扩增后的DNA片段、酶切 后的DNA片段 主要试剂：PCR:灭菌去离子水、2平「emix、引物1-S0100(10 mol/L)、引物2-SO101 (10 mol/L) 质粒DNA的提取与制备：LB培养基(液体、固体X Bioteke质粒提取试剂 盒(北京百泰克，中国、溶液P1、溶液P2、溶 液P3、去蛋白液PE、漂洗液WB、洗脱液EB 质粒DNA的定量：灭菌的去离子水 质粒DNA的酶切鉴定：无菌水、10xM酶切缓冲液、质粒DNA、Hind III DNA Marker 5000 DNA Marker 5000 琼脂糖凝胶电泳：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、 主要仪器与器材：PCR : PCR仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管 质粒DNA的提取与制备：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台 式离心机、咼压灭菌锅 质粒DNA的定量：紫外分光光度计(eppendorf公司生产\比色杯 质粒DNA的酶切鉴定：恒温水浴箱、微量加样枪、1.5mlEP管 琼脂糖凝胶电