小鼠骨髓细胞染色体标本制备和核型分析.pptVIP

小鼠骨髓细胞染色体标本的制备/观察/核型分析 武汉大学生命科学学院 染色体技术的发展 1920年提出； 直到1956年，Albert Levan和华裔学者蒋有兴应用低渗处理、秋水仙素和植物凝激素，才使该技术得到了实质性的发展和完善； 20世纪70年代，出现了多种染色体显带技术，提高了染色体分析的精确度； 20世纪80年代中期，荧光原位杂交、显微切割及染色体涂染等新技术的出现，使染色体细胞水平的研究与分子水平的探索衔接起来。 染色体技术的应用及其意义 染色体技术应用领域：临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学、特殊细胞的标记、杂种细胞的鉴定等。 染色体技术应用意义： (1)用于染色体组型分析； (2)物种的特征及种属亲缘关系； (3)分析物种的变异和进化过程； (4)识别单条染色体及基因定位； (5)染色体疾病研究、肿瘤学研究及产前诊断； (6)环境毒物、临床药物毒性检测。 常用实验生物和人细胞DNA含量与染色体数目 数目 （2n=？） 长度 （绝对长度、相对长度） 着丝粒位置 （M\SM\ST\T） 随体与次溢痕的数目、大小和位置 带型分析 染色体观察及核型分析 染色体技术在临床医学方面的应用 染色体标本材料来源及制备过程 植物细胞染色体制片技术(根尖、花粉母细胞等) 前处理-酶解去壁-低渗-固定-解离-染色-压片 动物染色体制片技术(骨髓细胞、体外培养细胞等) 取骨髓细胞(体外培养细胞)-低渗-固定-滴片-染色 人体染色体制片技术(体外培养组织细胞、外周血淋巴细胞、胸腹水细胞、胎儿绒毛标本、实体瘤标本、羊水细胞、及皮肤、肝、肾标本) 快速法：注射秋水仙素-低渗-固定-滴片-染色 一、目 的 要 求 1. 掌握小鼠骨髓细胞染色体标本的制备方法； 2.掌握染色体分组特征, 对染色体核型进行分析; 3.了解并制备小鼠染色体核型图。 二、实 验 原 理 染色体的形态结构在细胞增殖周期中是不断地运动变化的，一般在有丝分裂中期，染色体的形态最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标本获取的是中期细胞。 用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，从而积累大量处于分裂中期的细胞。骨髓细胞是一种增殖细胞，利用上述原理，通过常规的制片方法，观察小鼠骨髓细胞的染色体。 三、染色体制备的实验材料、试剂和用具 实验材料： 体重18~25g的小白鼠； 实验试剂： 200μg/ml秋水仙素、生理盐水、0.075M KCl低渗液、Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸=3：1）、pH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液； 实验用具： 眼科剪、眼科镊、草纸、1 ml注射器、 10 ml注射器、10 ml刻度离心管、低速离心机、恒温水浴锅、温度计、酒精灯、吸管、载玻片、染色架、100 ml盐水瓶、定时钟、废液缸、显微镜。 四、实 验 步 骤 1. 取材前小鼠按2μg/gBW 腹腔注射200μg/ml秋水仙素作用2.5 小时。 2. 取材：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出完整股骨并纱布擦净。 3. 收集细胞：剪去股骨两头，用生理盐水冲洗股骨髓于离心管中，反复数次，至骨髓发白，1500~2000r/min离心8 min，弃上清。 4. 低渗处理：将约7ml预热37oC的低渗液加入离心管中，吸管混匀，再置于37oC 恒温水浴锅中保温15min(中途用吸管混匀一次)。 5. 预固定：取出离心管，向管底加入1ml新配制的固定液(甲醇：冰乙酸=3：1)，混匀，平衡，800~1000 r/min离心10 min，弃上清。 6. 固定：向沉淀物中加入新鲜固定液5ml，用吸管轻轻吹打均匀，室温静置15min，平衡后800~1000 r/min离心10 min，弃上清。 7. 再固定：方法同步骤6。 8. 制备细胞悬液：弃上清，留下沉淀物，加固定液0.2~0.3ml，用吸管轻轻吹打均匀。 9. 滴片：取干净湿冷玻片，将其倾斜30o，取少许细胞悬液于玻片上一定距离2~3滴于载玻片上(不要重叠)，用口轻轻吹散，在酒精灯火焰过几下。 10. 染色：在玻片标本上滴加Giemsa染液(Giemsa原液：pH6.8磷酸缓冲液=1：9)并铺匀，染色15min，用细自来水缓缓冲去染液至干净，晾干。 11. 小鼠骨髓细胞染色体观察 （1）小鼠骨髓细胞染色体计数：选择20个染色体形态较典型、分散较好的分裂相计数小鼠骨髓细胞的染色体数。 （2）小鼠染色体形态的观察：小鼠的染色体呈“U”形，全部