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生物样品前处理 制作人：叶超 研究背景 生物样品种类 目录 生物样品储存 生物样品预处理 克服基质效应方法 生物样品中药物的分析测定是定量描述药物体内过程、 获得药代参数的重要手段之一 药物浓度低（血液中药物浓度、 一般处于ng-pg级水平） 干扰组分多（血液成分及其复杂， 包括基质，内源性物质及其代谢产物， 含有数百乃至几千种化合物） 药物在体内除原型还有代谢产物以及 和内源性物质结合多种形式存在 体内生物样品分析特点 体内生物样品分析特点 生物样品种类 生物样品种类选取的原则 能够反应出药物浓度与药物效应之间的关系 易于获取 便于处理、适合分析 根据不同目的要求进行选取 血液（全血、血浆、血清） 尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液、淋巴液、汗液等 非均匀生物样品 心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、子宫、肌肉、皮肤等组织、器官 全血 血浆 血清 选择血浆or 血清 选择血浆理由： 1)一般血浆中药物浓度高于血清中药物浓度 2)血清形成过程中，血块凝固时，往往易造成吸附损失 3)血清需要采血放置一段时间才可制得，对不稳定的化合物影响较大 4)血浆则可经采血后立刻离心，分离血浆低温保存 选择血清理由： 1)血浆中蛋白稍微多，可能会在SPE中产生堵塞柱子情况 2)血浆中含有抗凝物质（肝素或EDTA)可能会干扰化合物检测 生物样品的储存 一、冷藏或冷冻 采样后除了立即分析外，为防止药物发生变化，应： 短期保存，可4℃冷藏 长期保存，可-20℃冷冻，不要反复冻融（大部分药物） -80℃，阿莫西林等抗生素 二、有时，还应考虑加入稳定剂 酶抑制剂：一些酯类药物，如普鲁卡因、阿糖胞苷，易受血浆酯酶作用而发生水解，而应在采样后立即加入酶抑制剂如氟化钠。 抗氧化剂：一些易氧化的物质，可加入VC或其它氧化剂。如血浆中的儿茶酚类药物常规保存仅4周，若加入适量的VC，则能保存10周。 盐酸班布特罗（前药） 体内胆碱酯酶的 作用下缓慢代谢 阻断水解 毒扁豆碱 (胆碱酯酶抑制剂） 特布他林（代谢产物） 生物样品的储存和预处理(添加酶抑制剂) 生物样品的储存和预处理(避光） 生物样品的储存和预处理(PH值和温度） 生物样品预处理目的 1 2 3 将药物从缀合物（尿）或结合物中释放出来，以测定药物浓度 将微量药物从复杂介质中纯化、富集起来 防止分析仪器的污染，提高测定灵敏度和选择性 生物样品常用的处理方法 一 二 三 沉淀蛋白 (PPT) 液液萃取 (LLE) 固相萃取 (SPE) 主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方法三个方面的问题： 沉淀蛋白 通过沉淀蛋白质可以使结合的药物释放出来，达到对待测组分的提纯和纯化 有机溶剂沉淀法 加入中性盐 有机酸 加入锌盐或铜盐沉淀剂 酶解法 有机溶剂沉淀法 原理 加入水溶性有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化 常用有机溶剂种类 乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氢呋喃等 操作实例 50μl 血浆+150μl甲醇 涡旋1min 3500rpm离心10min 取上清液进样分析 有机溶剂沉淀法实例 奥氮平 有机溶剂沉淀法 血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:1~3，就可以将90%以上的蛋白质除去，采用低温低速3500r/min离心10min便可将析出的蛋白质完全沉淀。 经验总结 优点 操作简单，快速，精密度好，为方法开发中优先考虑使用的，特别在LC-MS方法中 几乎使用于所有小分子化合物，无论其极性大小 化合物回收率接近100%，几乎所有小分子化合物都被提取，尤其适用于代谢产物鉴定 缺点 只适用于样品中浓度较高的药物测定； 样品处理后仍然存在很多干扰物质，对结果产生干扰； 残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器 加入强酸 原理 当PH低于蛋白质等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀。 常用有机溶剂种类 10%三氯醋酸， 10%高氯酸等 经验总结 血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心，就可除去蛋白质 在酸性条件下分解的药物不宜本法除蛋白 头孢地尼 内标 头孢克洛 加入强酸实例 酶解法 原理 在测定酸不稳定及蛋白结合牢固的药物，需用酶解法，最常用的酶是蛋白水解酶的枯草菌溶素， 优点 可避免某些药物在酸、及高温条件下降解：对与蛋白质结合牢固的药物（保泰松、苯妥英钠)，可显著改善回收率 加入中性盐 原理 加入中性盐，使溶液的粒子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。 常用中性盐种类 饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐 操作实例 血清和饱和硫酸铵的比例为1:2，混合，离心10000r/min 1-2min，即可除去90%以上蛋白质 生物样品常用的处理方法 一 二 三 沉淀蛋白 (PPT) 液液