补充3--基因分析技术.pptVIP

(二)实时荧光定量PCR技术原理 所谓的实时荧光定量PCR，就是通过对PCR扩增反应中每一次循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计．荧光信号强度也等比例增加 一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系；只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，这时就可以选择在这个阶段进行定量分析 荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值．它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般将荧光阈值的缺省设置为3～15个循环荧光信号的标准偏差的10倍 Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为Ct值(threshold value) 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 三、相关仪器 PCR技术已成为基因分析工作的基础技术和有效工具，在检验医学等领域中使用广泛。其核心设备—PCR仪经过不断改进，已经越来越完善和智能化，分类也更加细化 (一)PCR仪的温控模式 ①模块温控模式(block contro1) 机器根据探测器直接探测的温控模块（即承载样品的金属台)的温度进行控制。 ②试管温控模式(tube contro1) 是一种模拟试管／PCR板的温控模式，根据探测器所测到的温控模块的温度由计算机计算出管内／PCR板孔内样品液的温度来进行控制；一般说来，试管温控更为准确 ③热敏电极温控模式(hot sensitive electrode control) 机器内的一个热敏电极插入一个专门的测量管中(管中装有矿物油)，反应进行时，将该测量管插入温控模块的样品孔进行检测。通过此途径就可以监测反应管内样品的实际温度 (二)实时荧光定量PCR仪 定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统 定量PCR仪的关键——由于定量PCR必须借助样本和标准品之间的对比来实现定量，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势；即可同时检测一个样品中的多种荧光，这样仪器就可以同时检测单管内多模板或者内标和样品的混合物，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大 另外，定量PCR仪需要考虑的一个因素是软件设计，目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用 1.定量PCR仪的组成及性能 2.实时定量PCR仪的主要类型 （1）传统的96孔板式定量PCR仪 以美国应用生物系统公司(ABI)为代表 优点：可容纳的样本量大而且无需特殊耗材，可以采用传统的96孔板甚至384孔扳进行批量的定量反应 缺点：①温度均一性不佳；②平板固定加热模块的PCR温度控制有边缘效应；③样品槽上每个孔之间的温度存在差异 ABI的定量PCR仪均支持两种定量化学：TaqMan荧光探针和SYGBR?Green I荧光染料。其增强的7900型在96孔模块的基础上还可以更换384孔板模块，使得高通量处理数据的能力大大增强，更适合处理大量标本 （2）离心式实时定量PCR仪 PCR扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样，借助空气加热和转子在腔内旋转，转子上每个孔都是“等位”的，几乎无差别，很好地解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题，最大限度地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性 优点：①升温速度快 ②每个样品管在检测时距离检测器和激发光源的距离都是“等价”一样的，使用的是同一个检测器和激发光源，有效减少了不必要的系统误差 ③大多采用了长寿的LED(发光二极管)冷光源．运行前无需预热，无需校正；系统检测重复性也更好 缺点：能容纳的样本量有限，有的还需要特殊的消耗品，增加使用成本 第二节　核酸分子杂交技术 一、基本原理 具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下根据碱基互补的原则可以形成双链 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基序列完全互补，只要有一定同源序列的单链彼此