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SSR分析的原理及操作技术 DNA分子标记技术类型 以Southern杂交为基础的分子标记技术： 限制性内切酶片段长度多态性标记（RFLP） 以PCR为基础的分子标记技术：随机引物PCR标记和特异引物PCR标记 随机扩增多态性DNA（RAPD） 扩增的限制性内切酶片段长度多态性（AFLP） 相关序列扩增多态性（SRAP） 简单重复序列（SSR）或简单序列长度多态性（SSLP） 以mRNA为基础的分子标记技术： 差异显示（DD） 逆转录PCR（RT－PCR） 以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术： 单核苷酸多态性（SNP） SSR简介 在生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列， 根据重复序列在基因组中的分布形式可分为： 串联重复序列（Tandemly repeated sequences） 分散重复序列（Interspersed repeated sequences） ? 依据重复基序的长度、拷贝数和位置等又将串联 重复序列分为： 卫星DNA：基序（motif）长10～300bp，甚至长1,000～100,000bp； 小卫星DNA：基序长10～60bp； 微卫星DNA：基序长1～6bp，其功能：重组热点、对基因的调节和表达以及性别决定等。 SSR简介 微卫星DNA即简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）， 或者微卫星序列（microsatellite，MS）， 又称短串联重复（short tandem repeats，STR）， 是一类由几个核苷酸（多为2～4个）为基本单位多次串联重复而形成的DNA片段，其长度一般较短，多在200bp以内。 ? 微卫星在植物基因组中的含量非常丰富，均匀分布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化非常大，但（AT）n最多。 SSR标记的基本原理 尽管微卫星DNA分布于整个基因组中的不同位置，但某一特定的微卫星的两端侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，将重复序列及其两侧的DNA片段进行克隆和测序，然后根据两端的侧翼序列设计一对特异引物，通过PCR技术将目的微卫星DNA片段扩增出来。 SSR标记的基本原理 由于单个微卫星位点的重复单元在数量上的不同，导致扩增产物在长度上发生变化，即产生长度多态性，这种多态性称为简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism，SSLP)，每一扩增位点就代表了该位点的一对等位基因。 SSR标记的多态性主要依赖于基本单位重复次数的变异，而这种变异在生物群体中是大量存在的，因此，SSR具有大量的等位差异，多态性十分丰富。 PCR技术的基本原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。 特点一：使特定的DNA片段得到了迅速大量的扩增，理论上的最高值达2n-2； 特点二：能够指导特定DNA片段的合成。 如何实现？ PCR反应体系 一对特异引物： 1.引物长度：典型的引物长度为18-24bp，引物需要足够长，保证序列独特性。但是长度大于24bp的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量； 2.引物浓度：一般0.1-0.5 ?mol/L，过高的引物浓度会加剧错配发生，特异性下降； 3.合理的G/C含量：一般为40％～60％。 PCR反应体系 Mg2＋溶液 ：其浓度直接影响引物退火的特异性、产物特异性以及酶的催化能力和准确性等，适当降低Mg2＋浓度可增加特异性。 模板DNA：一般1ng/1μL，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加； dNTP ：常用浓度为50-200?mol/L，种dNTP浓度应相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。 Taq酶 ：DNA聚合酶，热稳定，最适温度72 ℃，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 10×buffer缓冲液（不含Mg2＋ ）：维持PCR pH的稳定。 PCR循环条件 高温变性：双链DNA模板加热变性成单链； 低温退火：在低温下引物与单链DNA互补配对； 退火温度针对不同的引物差别较大，退火温度过低，极易形成非特异扩增，而退火温度过高，又难以扩增出条带，对于长度为20bp，GC含量为50％的核苷酸的典型引物，55 ℃是比较适宜的退火温度。 适温延伸：在适宜温度下Taq DNA酶催化引物沿着模板DNA延伸。 PCR条件优化 优化引物设计：这是最关键的，可以借助计算机来辅助设计引物。 热启动技术：在PCR反应的第一个循环中待温度升高且超过模板Tm值（80℃）后，再加入关键试剂如Taq