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蛋白质实验技术 杨琳（明理楼107） 课程介绍 选修课 选修课（34学时，2×16） 期末考试－闭卷笔答 成绩合算－期末×0.5＋平时×0.25+论文/上课讲解 自编讲义 课程内容： 介绍蛋白质性质、表达、分离、纯化以及鉴定过程中所涉及到的基本技术的基本原理、应用范围及注意事项。 主要参考书： 1『生物化学』－面向21世纪课程教材（第三版） 王镜岩,朱圣庚,徐长法主编 高教出版社 2『蛋白质技术手册』 汪家政，范 明主编 科学出版社 3『生物化学与分子生物学实验常用数据手册』 吴冠芸，潘华珍，吴 恽主编 科学出版社 4『蛋白质纯化指南 』 （第二版） R.R. 伯吉斯, M.P. 多伊彻 编著 陈薇 主译 科学出版社 5『蛋白质分析实验技术指南』李玉花 主编 科学出版社 第一章 绪论 牛胰岛素 人源葡萄糖转运蛋白GLUT1 牛胰岛素 提出---1958年与美、德科研小组同时独立提出这一课题 背景---1958年，没有不可征服的科学高峰 初期： 短暂的正常研究阶段 （已获得拆、合天然胰岛素等几项重要的成果。 ） 牛胰岛素 高潮：混乱的大兵团作战 （正常的科研程序被严重干扰；对参与研究的人员造成了很大的身体伤害 ） 苦撑：北大最少时只剩下两个科研人员 攻关：各单位放弃内部竞争通力协作，终于结出硕果 。 诺贝尔奖？ 葡萄糖转运蛋白 细胞的葡萄糖摄取通道 易化扩散 1，催化剂 －酶（碳酸酐酶） 2，结构成分 －胶原蛋白 3，贮藏功能 －麦醇溶蛋白（小麦种子） 4，运输功能 －血红蛋白（氧分子），跨膜运输 功能紊乱导致的疾病 功能紊乱导致的疾病 GLUT1功能完全缺失将致死 GLUT1在癌细胞的新陈代谢过程中也发挥着重要功能。 饿死癌细胞？ 结构解析 Linfeng Sun ，et al. 2013. Nature. 人源葡萄糖转运蛋白GLUT1 葡萄糖是地球上各种生物最重要、最基本的能量来源，也是人脑和神经系统最主要的供能物质。 须依靠转运蛋白这个“运输机器”来完成 GLUT1对健康的影响 GLUT1功能完全缺失将致死 GLUT1在癌细胞的新陈代谢过程中也发挥着重要功能。 GLUT1对健康的影响 GLUT1功能完全缺失将致死 GLUT1在癌细胞的新陈代谢过程中也发挥着重要功能。 团队：这项具有里程碑意义的科研成果是由一个清华大学的年轻团队完成的 ，第一作者邓东博士为80后 ，三位共同第一作者都是90后 。 细胞培养 提纯蛋白 蛋白结晶 为什么要纯化酶？ 不要把你纯粹的思想浪费在不纯的酶上！ ---Efraim Racker 经典酶学方法：20世纪初无细胞条件下蔗糖 乙醇 ---Eduard Büchner 从现象追踪到功能（乙醇发酵、糖酵解等） 目录 主要仪器介绍和安全规范 蛋白质样品制备 蛋白质的表达与纯化 蛋白质与其他物质的相互作用 第一讲 主要仪器介绍和安全规范 离心机操作注意事项 使用之前要仔细阅读说明书 了解： 最大转速、所需转头、温度。提前预约。 操作： 检查转头是否牢固固定 检查盖是否完全吻合盖好 提前预冷，预冷时要拧好盖 严格配平 操作过程若暂时不用要盖上机盖 升速和降速过程要多加注意 噪声大时要选择降速并联系老师 使用后： 离心机使用完毕后，若有液体溅出要联系老师取出转子，清洁后倒置放在干燥、平稳的地方。 转子清洁时只能用中性洗涤液，禁止用腐蚀性液体擦拭。 使用致冷功能后在关闭电源时不要盖上离心机盖，应待离心机腔体内冷凝结的霜完全融化后，用干净的软布擦干水滴并充分晒干后再盖上离心机盖，否则会导致机器生锈。 仪器断电后再开机应间隔3分钟以上，防止损坏压缩机。 高压灭菌锅操作步骤 高压灭菌锅操作步骤 高压灭菌锅操作注意事项 * * 1923年，班丁(F．G．Banting)和麦克劳德(J．J．R．Mac．1eod)因为发现胰岛素和使用胰岛素治疗糖尿病而荣获了医学和生理学诺贝尔奖； 1955年，维格纳奥德因为合成多肽激素催产素而获得诺贝尔化学奖； 1958年，桑格因为分离和确定胰岛素的氨基酸组分的构成而荣获诺贝尔化学奖； 1972年，安芬森(C．B．Anfinsen)等人因为发现氧化被还原的核糖核酸酶肽链能恢复活力而获得诺贝尔化学奖； 1984年，梅里菲尔德(R．B．Merrifleld)因为发明固相合成方法而获得诺贝尔化学奖。 与糖尿病的关系 与肿瘤的关系 Mueckler, M. et al. Science 229, 941–945 (1985) Amann,