第六章 沉淀法和吸附法.pptVIP

(一)盐析法 (二)有机溶剂沉淀法 (三)等电点沉淀法 (四)生成盐复合物沉淀法 一、 沉 淀 法 沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液 中的溶质由液相转变为固相析出的过程。 ①盐析法:多用于分离纯化各种蛋白质和酶。 ②有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸等 产品的分离纯化，也有用于蛋白质的沉淀。 ③等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质 的沉淀。 ④生成盐复合物沉淀法：用于多种化合物，特别是小分 子物质的沉淀。 (一)盐析法 高浓度的中性盐能破坏蛋白质、酶等的胶体性质， 中和微粒上的电荷，促使蛋白质等发生沉淀或絮凝现象。 logS＝β- Ks?Ⅰ S—离子强度为Ⅰ时的蛋白质的溶解度； Ks—盐析常数，与温度和pH无关； β值—是溶质的特征常数，对于蛋白质而言，其大小主要取决于不同蛋白质的性质，它也与溶液的温度和pH值有关，但与盐的种类无关;为便于计算，用盐的摩尔数m代替离子强度I，则 logS＝β-Ks? m 盐析机理示意图 盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降； 盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降； 盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。 碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图 pH6.6，温度25℃，logS0=17g·L-1 不同蛋白质的溶解度曲线 蛋白质的盐析分布曲线 溶解度曲线(a)和盐析分布曲线(b) 蛋白质起始浓度的影响 无机盐种类的影响 温度的影响 pH对β的影响 二次盐析 (二)等电点沉淀法 是利用两性电解质在电中性时溶解度最低的 原理，进行物质分离纯化的方法。 中性盐的浓度增加时，相应于最低溶解度的pH值 向偏酸方向移动；同时最低溶解度会有所增大。 等电点沉淀法应在低离子强度下操作。 许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范围内。 (二)等电点沉淀法 是利用两性电解质在电中性时溶解度最低的 原理进行物质分离纯化的方法。 中性盐的浓度增加时，相应于最低溶解度的pH值 向偏酸方向移动；同时最低溶解度会有所增大。 等电点沉淀法应在低离子强度下操作。 许多蛋白质的等电点都在偏酸性的范围内。 许多无机酸的价格低廉，并能为食品标准允许。 等电点沉淀实例 从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3.0)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 等电点沉淀实例 碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH 4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH 9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。 (三)有机溶剂沉淀法 许多水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等 能使溶于水的小分子生物物质以及核酸、多糖、 蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。其主要作用 是降低水溶液的介电常数。 有机溶剂沉淀原理图 分辨能力比盐析法高 一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀 沉淀不需脱盐 有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大， 容易进行固液分离 有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留， 因此适用于食品、药品的制备。 容易引起蛋白质变性失活 有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高 需冷却、降温、低温操作。 2、影响有机溶剂沉淀的因素 有机溶剂的种类：选择的溶剂必须能与水互溶，但与产物如蛋白质等不发生反应。 温度：降低温度可以增加收率。同时许多生物分子如蛋白质、核酸等对温度特别敏感，温度稍有升高，便发生变性。 pH：选择溶解度最低时的pH，有助于提高沉淀效果。因此在接近等电点处，以引起沉淀所需有机溶剂的量较少。合适的pH也可大大提高分离的分辨能力。 样品浓度和分子质量：低浓度样品需用有机溶剂的量较大，但共沉作用小，有利于提高分离的效果；但低浓度样品损失较大，回收率低，具有生理活性的样品容易产生稀释变性。 金属离子和离子强度：Mn2+、Fe2+、Co2+、Zn2+等阳离子能与蛋白质中的羧基、氨基和含有氮杂环的