实验四花粉发育时期的鉴定与花药培养.doc

实验四 花粉发育时期的鉴定与花药培养 一、实验目的 花药和花粉培养中，花粉的发育时期是提高植株诱导频率的重要因素。准确地鉴定花粉的发育时期。适时接种是花药、花粉离体培养中十分重要的操作技术。 本实验的目的是学习花粉发育时期的镜检技术，识别关键时期的细胞学特征，同时学习花药培养的操作技术。 二、实验用具和药品 1. 实验用具：显微镜、载玻片、盖玻片、滤纸、超净工作台、镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯、培养皿等。 2. 药品试剂：醋酸-洋红液、HgCl2、70%酒精、灭菌蒸馏水、培养基用各类试剂药品等。 三、实验材料 不同植物各发育时期的花蕾。 四、实验方法 （一）取固定液中花药一个，置于载玻片上，用吸水纸吸去固定液，滴上一滴醋酸洋红染色液，用解剖针大头一端，在染色液中将花药轻轻压碎，目的是使花粉从药囊中游离出来。然后弃去药壁残渣，盖上盖玻片。在酒精灯火焰上迅速来回轻烤几次。目的是破坏染色质，促使细胞核着色，同时驱赶气泡。可随时用手背试测温度，注意不可过热或煮沸，待制片冷却后，可在显微镜下检查。 （二）花药愈伤组织的诱导　镜检确定花粉发育时期，选取花粉处于单核中晚期的花蕾，用0.1%氯化汞溶液整体灭菌10min，无菌水冲洗3-5次，剥取花药，接种到5种诱导培养基上以筛选最适培养条件。 1. MS+2,4-D 0.2mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L 2. MS+2,4-D 0.2mg/L+KT 1.0mg/L 3. MS+2,4-D 0.5mg/L+KT 1.0mg/L 4. B5+2,4-D 0.2mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L 5. B5+2,4-D 0.2mg/L+KT 1.0mg/L （三）培养条件 黑暗条件下预培养3d,后转入正常光照条件下继续培养。在愈伤组织转移出来之前统计花药愈伤组织诱导率。 愈伤组织诱导率=(形成愈伤组织花药数/接种花药数)×100% 五、花粉发育时期的特征 （1）四分孢子期：花粉经过减数分裂后，形成连在一起的四个孢子。显微镜检时，在一个平面上往往只能看到三个小孢子及小孢子核。在同一平面上看到四个小孢子及小孢子核的情况较少。 （2）单核期：又分为单核早期、单核中期、单核晚期。 单核早期：细胞体积较小，核较大、位正中，细 胞质没有液泡化。 单核中期：细胞体积增至正常大小。细胞质中开始出现小液泡，细胞核开始向边缘移动。 单核晚期：胞质中小液泡连成大液泡。核被挤到边缘靠近细胞壁。这一时期也称单核靠边期。 （3）双核期：单核小孢子第一次有丝分裂后，形成两个形态、大小不同的子核。一个是染色质松散、染色较浅的营养核。另一个是染色质紧密，染色较浓的生殖核。 （4）三核期：三核期由于淀粉的大量积累，细胞核内状况不易观察。二核型花粉生殖核的分裂往往要在花粉发芽之后才能见到。 六 实验结果 1认真镜检花粉发育图,并观察结果: 图略 2统计实验数据,比较并确定最佳培养条件: 培养基 接种数 愈伤形成数 愈伤诱导率 污染数 污染率 1 24 17 70.8% 3 12.5% 2 24 18 75% 0 0% 3 25 5 20% 8 32% 4 26 15 57.7% 0 0% 5 27 21 77.8% 0 0% 从以上实验统计结果可以初步判断出1号与5号培养基的愈伤组织诱导率较高,分别为70.8%.77.8%.故5海培养基用于花药培养最适宜,但此实验由于每组人员只接种一种培养基,污染率也较高,影响统计结果,使得整个实验的可信度并不高.