环境微生物菌种鉴定.ppt

企业生产过程微生物污染控制实例分析--无菌制剂生产过程微生物菌库的建立和种属鉴定; 一、立项目的 二、采样方案 三、试验材料及仪器设备 四、鉴定方法 五、鉴定结果 六、结果分析 七、讨论 ; （1）为了了解无菌制剂生产过程中微生物污染情况，即微生物种类及分布情况，实现生产环境微生物、操作过程微生物与药品中污染微生物的比较和溯源分析，以便达到生产过程微生物实时有效动态控制目的。从而满足药品GMP对无菌制剂生产过程中微生物污染的监测和控制要求。 （2）生产企业也可以利用这些数据，对无菌制剂生产过程进行微生物风险评估。; 1. 采样区域的确定 2.采样对象及方式的确定 3.采样频次的确定 ;根据车间的面积、房间数，考虑到可能影响到产品质量的关键区域及易于受到微生物污染的关键部位的分布，设定了监测点及采样方案。 企业按照中国新版药品GMP的要求，将洁净区划分为A级（动态100级）、B级（静态100级）、C级（10000级）、D级（100000级）。 微生物采样点分布图见图1和图2。其中一车间采样点共39个，二车间采样点共98个。;1. 采样区域的确定（一车间）;1. 采样区域的确定（二车间）;;企业根据生产情况和制剂车间的使用频次按季度制定采样频次 ，共收集4个季度的样本。; 1．样本来源 2．培养基 3．仪器设备 4．试剂试药 ; 1．样本来源 无菌制剂一车间和二车间286份样本 2．培养基 胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA），批号：1221965，BD公司； 麦康凯琼脂（Mac），批号：1108423, BD公司； MRS琼脂，批号：100915，北京陆桥技术有限责任公司 ; 3．仪器设备 全自动微生物生化鉴定仪（Viteck 2 Compact）：法国生物梅里埃公司； 麦氏浊度比浊仪：法国生物梅里埃公司； BX 41 光学成像显微镜：日本奥林巴斯公司； 卡玛薄层色谱成像仪:瑞士CAMAG卡玛公司。 API RP ; 4．试剂试药 革兰氏染色液：青岛高科园海博生物科技有限公司； GN鉴定卡、GP鉴定卡、BCL鉴定卡、YST鉴定卡、ANC鉴定卡：法国生物梅里埃公司。 API RP ;鉴定流程图 ; 1.菌种的纯化与复壮 采集的微生物可能在物理的、化学的消杀条件下暴露 了较长时间，菌株本身可能存在一定的损伤和变异 ，有必 要对送检菌株进行复壮和再次纯化。 首选的复壮及纯化培养基为胰酪胨大豆琼脂培养基 （TSA）;对于革兰氏阴性菌，在无法与革兰氏阳性菌区分 的情况下，也会选择MaC琼脂作为纯化培养基；对于较难 培养的菌株，也采用血平板、改良MRS琼脂等进行纯培 养。; ;溶血葡萄球菌 ;施氏假单胞菌 ;2.革兰氏染色及镜检 表皮葡萄球菌 ;2.革兰氏染色及镜检 缓慢芽孢杆菌 ;2.革兰氏染色及镜检 施氏假单胞菌 ;3.生化鉴定 （1）采用全自动微生物生化鉴定仪（Viteck 2 Compact），根据革兰染色结果选择鉴定卡。 （2）将24小时培养物，用0.45%无菌氯化钠 溶液制备一定浊度的菌悬液，将64个生化反应 集成到Viteck鉴定卡上，一般2-10小时左右给出 鉴定结果 。 （3）结果判断：相似度96%-99%为极好，95%-92%为较好，91%-89%为好，88%-85%为可以接受，85%以下的相似度为低分辨率的鉴别。对于只鉴定到属的鉴别，还需根据提示信息进行补充试验，进一步甄别到种。 ;（一）人员环境总体结果 一车间：110株 其中：人员67株 环境43株 二车间：182株 其中：人员133株 环境49株 总计：292株，其中阳性球菌109株（37.3%） 阳性芽孢杆菌 114株（39.0%） 阳性无芽孢杆菌 22株（7.5%） 阴性杆菌 39株（13.4%） 2010-