雷帕霉素对成肌细胞治疗骨骼肌损伤的影响及其作用机制-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本论文属于 必威体育官网网址□，在 年解密后适用本授权书。 不必威体育官网网址□。 (请在以上方框内打“√”) 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 摘 要 成肌细胞是指含有肌丝的肌组织前体细胞，存在于胞浆中，具有自我更新、增 殖、分化最终融合形成新肌纤维的再生能力。截至目前，成肌细胞移植已应用于杜 氏肌营养不良和心肌梗塞等肌病的临床前研究，但治疗效果并不理想。有研究报道， 宿主的免疫应激是导致成肌细胞移植后迅速死亡并制约其临床应用的关键因素之一。 雷帕霉素作为免疫抑制剂可成功应用于成肌细胞的异体移植。然而，在肌损伤缺营 养微环境条件下的作用机制目前仍不十分清楚。本课题首先通过血清饥饿处理模拟 体内缺营养微环境，MTT 实验体外评价雷帕霉素分别对处于增殖和分化阶段成肌细 胞系 C2C12 活性的影响，并进一步通过分子生物学和细胞生物学手段揭示雷帕霉素 对在饥饿处理条件下成肌细胞肌发生过程的作用机制。基于体外细胞实验结果，构 建动物体内比目鱼肌损伤模型，在雷帕霉素和成肌细胞联合治疗作用下，开展体内 动物损伤后肌肉再生修复的实验研究。 1. MTT 法检测七种不同浓度梯度(200 ng/ml, 150 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 20 ng/ml, 10 ng/ml 和 5 ng/ml) 雷帕霉素对饥饿和未饥饿处理的 C2C12 细胞增殖、分化 期细胞活性的影响。值得注意的是，处于分化阶段的细胞，除 200 ng/ml 浓度雷帕霉 素作用外，细胞活性与正常对照组相比均无明显差异。考虑到成肌细胞治疗途径主 要是通过体外大量扩增后回输至宿主体内肌肉损伤部位，因此，本课题筛选 150 ng/ml 雷帕霉素拟作为理想最大免疫抑制浓度，进行肌发生过程的机制研究。 2. 研究雷帕霉素对饥饿预处理成肌细胞肌发生过程的影响及其作用机制。结果 表明：（1）采用 Annexin V-FITC/PI 法流式分析研究发现雷帕霉素对成肌细胞有较好 的 保护 免凋亡 作用 ；（ 2 ） 实时 荧光 定量 分析 发 现 雷 帕 霉 素 对 肌源性 调控因子 (Myogenic regulatory factors, MRFs)和肌肉抑制素(Myostatin)的拮抗基因 follistatin 存 在表达差异：a、无论饥饿处理与否，增殖期的成肌细胞中 MyoD1 和 follistatin 基因 表达均较高于对照组，其中 MyoD1 基因达极显著水平（P 0.01），有利于细胞向肌 源性分化的方向进行； b、对于分化期的成肌细胞，饥饿预处理和未经饥饿处理的 正常分化细胞则呈现明显不同的表达差异，就未饥饿处理的正常分化细胞而言，雷 I II万方数据 II 万方数据 帕霉素显著抑制对成肌细胞分化过程起重要作用的调节因子 myogenin 和 MRF4 基因 的表达；然而，对于饥饿预处理细胞， myogenin 和 MRF4 基因表达量相对增加，且 在雷帕霉素作用下 72 h，对成肌细胞终末分化起重要角色的 MRF4 基因表达量明显 上升，达极显著水平（P 0.01）；与此同时，促肌发生过程调节作用的 follistain 基因 在饥饿预处理细胞中表达也相对较高，雷帕霉素作用 72 h 表达量达极显著水平（P 0.01），有利于成肌细胞向肌发生过程且减少体内肌损伤纤维化的方向进行；（3）半 定量 RT-PCR 时空表达分析发现，无论饥饿预处理成肌细胞与否，雷帕霉素对肌发生 增殖和分化过程分别起重要调控作用的 MAPK/ERK 和 PI3K/Akt 信号通路与对照组 相比均无明显差异；（4）Western-blot 研究发现，饥饿预处理后，雷帕霉素作用 48 h 能促进增殖期细胞中 MyoD1 蛋白表达，达极显著水平（P 0.01），这与前期荧光定 量分析结果相一致；然而对分化期细胞的 Myogen