酪氨酸羟化酶基因转染神经干细胞及表达-外科学(神经外科)专业论文.docxVIP

酪氨酸羟化酶基因转染神经干细胞及表达摘 酪氨酸羟化酶基因转染神经干细胞及表达 摘 要 ／帕金森症(Parkinson’sdiseaSe．PD)的基本病理改变为中脑黑质多 巴胺能神经元进行性坏死，同时神经元内多巴胺合成代谢过程中的限速 酶——酪氨酸羟化酶(Twosinehydrox)rlase，TH)含量下降，其结果导致 纹状体区多巴胺含量的显著减少，引起各种临床症状。目前PD的非手 术治疗，以补充多巴胺合成的前体物质左旋多巴(L．3， 4-dihydroxyphenylalanine．L．dopa)为主，但随着疾病的发展，存活的多 巴胺能神经元及其酪氨酸羟化酶含量进一步下降，即使补充大量各类药 物，也难以达到满意疗效。因此，有效地增加纹状体区多巴胺能神经元的 数量，增强神经元合成多巴胺神经递质的能力，是治疗PD的关键措施。 在脑纹状体内移植多巴胺能组织，以提高脑内多巴胺神经递质的含量， 正发展成为一种新的治疗方法。脑内移植胚胎中脑组织治疗PD的效果 得到广泛确认，但是这种方法也存在一定的局限性，首先要同时获得数 个胎龄相似的用于脑内移植的胚胎非常困难，其次在伦理学上也存在激 烈的争论，在很大程度上限制了这种方法的广泛应用。为了增加纹状体 多巴胺的含量，研究者们将成纤维细胞、成肌细胞等经基因工程改造使 之表达酪氨酸羟化酶移植到纹状体内，增加多巴胺递质的含量．以达到 治疗PD的目的，但是这一类非神经源性细胞不能在宿主脑内长期存活， 不能与宿主脑神经发生神经整合，作用时间较短，效果仍不理想。因此， 寻找一种既能与宿主脑发生神经整合，在宿主脑内长期存活，又易于获 得，易于在体外培养增殖，便与进行基因操作，表达酪氨酸羟化酶的的 细胞供体源，用于脑移植治疗PD将有重要的意义。 自90年代初以来，学者们在对神经发育的研究中发现一类广泛存在 于哺乳动物CNS的未分化细胞。这类细胞具有自我分裂，自我复制，自 V 我更新及自我维持的能力，并具有多种分化潜能，研究者认为这一类细 我更新及自我维持的能力，并具有多种分化潜能，研究者认为这一类细 胞属于神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)。神经干细胞可在体外培养， 长期传代，大量增殖，在体外诱导因子的作用下可以分化发育为成熟的 各种神经细胞表型，尤其是分化成熟的神经元具有完整的电生理功能， 脑内移植后篚长期存活，并与宿主脑细胞之间产生神经整合，建立起复 杂而广泛的突触联系。由于NSCs易于获得，在体外增殖迅速，便于进 行基因工程操作，是基因治疗CNS疾病的理想载体细胞J本研究中，我 们从胚胎16天(Embrynoic day 16．E16)Wistar大鼠前脑室管膜下周围 区分离、鉴定、培养增殖了神经千细胞。同时，我们将缺陷性逆转录病 毒载体N2A与多巴胺合成的限速酶基因TH一起构建了表达质粒，然后 将该表达质粒转染PA3】?细胞，收集经PA3 J7包装产生的含TH．N2A具有 感染能力的逆转录病毒颗粒。并将收获的TH．N2A病毒感染体外培养的 神经干细胞，诱导其分化后，用免疫荧光细胞化学的方法检测到了TH 基因在分化细胞内的表达。f实验结果如下： 1．构建并扩增TH-N2A表达质粒。 2．分离、鉴定、大量增殖和搜集了E16Wistar大鼠前脑室管膜下周 围区的NSCs。 3．建立了THoN2A转染NSCs的有效方法，探索了逆转录病毒表达 质粒转染NSCs的最佳条件。 4．以不同的条件在体外诱导NSCs分化为神经元和神经胶质细胞， 验证了所分离的NSCs具有多分化潜能。 5．证实了转染TH-N2A的NSCs分化为神经元及胶质细胞后都能有 效地表达TH，并且，NSCs的神经生物学特征不因丁H．N，A的转染而发 生变化。、P 总之，／本实验成功地进行了NSCs的分离、鉴定及体外培养．并完成 了重组逆转录病毒载体质粒N2A．TH对NSCs的转染，证实了TH在分化 细胞中的表达，我们认为可在体外培养，大量扩增，并容易进行TH基因 转染，且能表达TH的NSCs可以作为脑内细胞移植治疗PD的供体源。 关键词：神经干细胞?酪氨酸羟化酶、基因工程：帕金森病。 V】 The The Transfection and Expression of Tyrosine Hydroxylase in Neural Stem Cells Abstract The progressive loss of dopaminergic cells and a deficiency of BTosine hydroxylase CrH)in substantia nigra aye the major pathological characteristics ofPa．fldnsons disease∞)，re砌血g