联合调控PPARγ及CGRP基因表达预防酒精性股骨头坏死的实验研究-外科学(骨科)专业论文.docxVIP

中文摘 中文摘要 万方数据 万方数据 研究目的 通过构建能够沉默 PPARγ，同时表达 CGRP 的双基因重组载体，观察联合 调控 PPARγ 基因和 CGRP 基因的表达对酒精诱导下兔 BMSCs 成脂、成骨分化 能力的影响；采用致敏法与酒精灌胃法制作兔酒精性 ONFH 模型，将双基因重 组载体转染的 BMSCs 植入动物模型股骨头内，观察其对酒精性股骨头坏死的预 防效果，对预防股骨头坏死的进一步研究提供新的实验基础。本研究分为以下 三个部分： 第一部分：沉默 PPARγ 表达 CGRP 基因重组载体的构建与鉴定 方法 （1）发卡样 siRNA（shRNA）寡核苷酸链的设计与合成：按照 siRNA 片段 的设计原则，依据 GenBank 中 PPARγ 的基因序列，筛选并合成合成 2 条 PPARγ siRNA 寡核苷酸链，3和 5端分别加入 BamHⅠ和 HindⅢ的酶切残基，并在设计 时改变 BamHⅠ酶切位点的一个碱基。 （2）兔 CGRP 基因完整 ORF 克隆：前期得到兔 CGRP 基因完整 ORF 克隆， 设计其两端带 MluI 酶切位点，与 TGFP 融合蛋白表达单元间用一段柔性链连接。 （3）重组载体的构建：发卡样 siRNA 寡核苷酸靶序列退火后克隆入线性化 pGFP-V-RS 载体，得到沉默 PPARγ 的沉默载体 pGFP-V-RS-siPPARγ；CGRP 基 因 ORF cDNA 纯化后与线性化 pGFP-V-RS 载体连接，得到表达 CGRP 的表达载 体 pGFP-V-RS-exCGRP ； CGRP ORF cDNA 片段克隆入 沉默 载体 pGFP-V-RS-siPPARγ ，得到沉默 PPARγ 、表达 CGRP 双基因载体 pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP。 结果 经酶切和DNA测序鉴定正确，三种重组载体构建成功，为进一步观察双基 因重组载体对酒精诱导下BMSCs成脂、成骨分化的影响提供实验基础。 第二部分：联合调控 PPARγ 及 CGRP 基因表达对酒精诱导兔骨髓间 充质干细胞分化的影响 II 方法 （1）密度梯度离心法获取兔 BMSCs，流式细胞仪行表面抗原 CD29，CD34、 CD44、CD45、CD105 鉴定。 （2）应用 BTX ECM 2001 电转仪系统将重组载体分别电转入 BMSCs 中，并 在需要酒精诱导的各组中加入酒精，终浓度均保持在 0.09mol/L，同时设立对照 组。MTT 法检测各组细胞增殖情况。细胞培养 7 天、14 天时，TaqMan RT-PCR 和 Western blot 检测 PPARγ、CGRP、Runx2、osteocalcin mRNA 及蛋白的表达。 细胞培养 14 天检测各组细胞内甘油三酯含量、碱性磷酸酶（ALP）活性、培养 基中骨钙素含量、层粘连蛋白含量、I 型胶原含量，并行 ALP 染色。细胞培养 21 天，行油红“O”脂肪染色。 结果 （1）流式细胞仪检测表面标志物结果显示，BMSCs表达CD29、CD44、CD105， 阳性率分别为99.86%，99.34%，99.65%；CD34、CD45呈阴性，阳性率分别为 1.27%，1.45%。得到高纯度的BMSCs。 （2）酒精诱导下，转染沉默载体pGFP-V-RS-siPPARγ的BMSCs组中，细胞增 殖曲线稍低于正常组，无显著性变化（P0.05）；PPARγ、Runx2 和Osteocalcin mRNA及蛋白的表达与正常组中接近，差异无统计学意义（P0.05）；细胞中甘 油三酯含量、ALP活性、培养基中骨钙素含量、层粘连蛋白含量、I型胶原含量 与正常组接近，差异无统计学意义（P0.05）。实验第14天时，ALP染色结果显 示，部分细胞胞浆染色为蓝/紫色，与Normal组接近。实验第21天，细胞中没有 脂滴发现或极少发现，油红“O”脂肪染色结果显示，细胞中极少有橘红色脂滴发 现。 （3）转染表达载体pGFP-V-RS-exCGRP的BMSCs组中，细胞增殖曲线稍低于 Normal组，无显著性变化（P0.05）；能稳定表达CGRP mRNA及蛋白；PPARγ mRNA及蛋白的表达、细胞中甘油三酯含量高于正常组，差异有统计学意义 （P0.05）；Runx2 和Osteocalcin mRNA及蛋白的表达、细胞中ALP活性、培养 基中骨钙素含量、层粘连蛋白含量、I型胶原含量稍低于正常组，差异无统计学 意义（P0.05）。实验第14天时，ALP染色结果显示，部分细胞胞浆染色为蓝/ 紫色，与Normal组接近。实验第21天，细胞中可以见到大小不一的圆形脂滴， 表现为折光较强的圆形黑色颗粒环，油红“O”脂肪染色结果显示，细胞中可见大 III 量橘红色脂滴形成。 （4）转