雷公藤甲素对腹腔激活巨噬细胞免疫功能抑制作用和凋亡诱导的实验研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

华中科技大学同济医学院 华中科技大学同济医学院 硕士擘住论文 DNA deoxyribonucleic acid EB ethidium bromide EDlA ethylene diaminetetra-acetic acid FCS fetal calf serum IL．6 interlekin．6 TNF—a tumor necrosis factor-a N0 nitric oxide bp base pairs LPS lipopolysaccharide M mole／L gram or gravity mln minute mmol millimole／1 V volt “1 microliter UV ultra．violet Iris trisoaydroxymethyl)aminomethane OD260 optical density at 260nm PBS phosphate buffered-saline RNase ribonulease SDS sodium dodecyl sulfate TBE tris／borate electrophoresis(buffer) TE tris厄DTA cDNA complementary DNA mRNA messenger RNA rpm round per minute DEPC diethyl p)roc百bonate EM endometriosis TP triptolide 华中科技大学同济医学院 华中科技大学同济医学院 硕士擘住论文 雷公藤甲素对腹腔激活巨噬细胞免疫功能抑 制作用和凋亡诱导的实验研究 华中科技大学同济医学院基础医学院 生物化学和分子生物学系 硕士研究生： 王辉丽 导 师： 杨业金 戴五星 中文摘要 腹腔微环境的改变是目前子宫内膜异位症(EM)研究热点之一。 近5年研究资料表明EM的发病机制与异位组织凋亡减弱和腹腔中活化 的巨噬细胞(M(P)受累有关，而受累的M(p不能正常凋亡，其分泌 (IL一6，TNF-a,NO等)功能加强又促进了异位组织对凋亡的抵抗力。雷公藤 甲素(triptolide，TP)是以卫茅科雷公藤属木质藤本植物雷公藤 (tripteryginm wilfordii hook f)中分离到的一种二萜内酯化合物。近年 的研究相继发现TP有抗炎、抗菌、抑制免疫和促进肿瘤细胞凋亡的作用， 但其对Mop的免疫抑制作用及Mop和异位内膜细胞的促凋亡作用却未见 报道。 为了探讨TP对激活M(p分泌功能影响及其凋亡诱导作用，我们以 小鼠腹腔激活Mcp和临床经腹腔镜确诊EM病人腹腔M平为模型，开展 了下述三个方面的研究。 华中科技大学同济医学院 华中科技大学同济医学院 硕士擘住论文 第一部分 雷公藤甲素对小鼠腹腔液中活化巨噬细胞 TNF．a、NO和IL．6生成的影响 目的探讨TP对小鼠腹腔激活M(p免疫抑制作用机制，为EM腹 腔激活M(p的抑制作用研究提供实验依据。应用脂多糖(LPS)体外激活小 鼠腹腔M(p后其吞噬能力大大增强的特性建立动物实验细胞模型检测其 在不同剂量TP和不同时间段杀伤活性、NO分泌和IL一6分泌的改变。 方法体外分离、纯化和培养由LPS诱导激活的小鼠腹腔M译， 采用四唑盐比色(MTT)间接法观察其在不同时间段和不同剂量下杀伤 活性的变化并采用半定量RT-PCR检测TNF．a在mRNA水平基因表达的 变化，用硝酸还原酶法(Gness法)检测其上清NO的含量变化，酶联 免疫吸附(ELISA)方法检测IL．6的分泌变化情况。 结果在1～109∥ml范围之内及24小时之内TP对M母杀伤活性 和NO产生具有明显抑制作用(Po．01)且呈剂量和时间依赖关系．在 1099／ml之内无细胞毒性，目．TP能明显抑制肿瘤坏死因子mRNA的基因 表达。在TPl04、10‘。、10～、1、109∥ml不同浓度下对M(D作用12小 时后其分泌IL．6细胞因子受到明显抑制。 结论TP能有效抑制小鼠腹腔液中活化M(pNO、IL一6的生成，降 低其杀伤活性并且从基因表达水平也研究证实能抑制TNF．a的表达，为 临床治疗子宫内膜异位症提供一定的实验依据。 【关键词】 TP 巨噬细胞 NO IL一6 TNF．a MTT ELISA Rrr-PCR 华中科技大学同济医学院 华中科技大学同济医学院 硕士学住论文 第二部分雷公藤甲素对小鼠腹腔液中活化巨噬细胞 凋亡的影响 目的 研究TP对小鼠腹腔激活M母凋亡的影响，为EM的治疗 提供实验依据。 方法 用不同浓度(10‘2、10～、1、109∥m1)TP与小鼠腹腔激 活M母体外共同培育，测定M9存活率；采用琼脂糖凝胶电泳(DNA ladder)观察M母凋亡的发生情况。 结果 用药组