第04章-免疫组化技术-2.ppt

（三）间接法-异种动物抗体法 所用的特异性抗体来自不同种动物，如兔抗X血清，由鼠抗Y血清，然后用FITC标记羊抗兔IgG，TRITC标记猪抗鼠IgG作为相应的二抗。染色时，不同的一抗可以混合在一起，不同的二抗也可混合在一起，按间接免疫荧光法步骤进行。当一抗分别与切片上的X、Y抗原结合后，再用混合二抗与之反应。由于兔和鼠IgG的Fc段抗原有种属特异性，因此羊抗兔IgG和猪抗鼠IgG各自与相应的Fc段抗原结合，不会交叉反应，X抗原即被FITC标示，Y抗原则为TRITC标示。这一方法的特异性与直接法一样，但敏感性高于后者。 （四）间接法-同种动物抗体法 本法应用兔抗X、兔抗Y抗原的血清为一抗，二抗也可由一种动物产生，如羊抗兔IgG，但是用不同的荧光素如FITC及TRITC分别标记，以显示肽类抗原的方法为例，操作步骤如下： （1）石蜡切片厚3~5μm，脱蜡进水。 （2）以l%人血清白蛋白（HAS）或10%正常羊血清作用10min，阻断切片对蛋白质非特异性吸附。 （3）用适当稀释的兔抗X血清与之反应，一抗的稀释度及反应时间均按间接免疫荧光法摸出的最佳条件而定。 （4）以0.05mol/L TBS（pH7.4、内含l%Triton Xl00，下同）洗5min，共3次。 （5）TRITC标记的羊抗兔IgG在室温下反应1h。 （6）PBS洗10min，共3次，这时第一重染色已完成，X抗原由TRITC显示。 （7）切片逐级乙醇脱水，二甲苯透明，空气中干燥后，置多聚甲醛密闭容器中，80℃温箱内以甲醛蒸气固定2~4h，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活。 （8）将切片以TBS洗5min，共3次。 （9）1%HAS（或10%正常羊血清）作用30min。 （10）再以适当稀释的兔抗Y血清及FITC标记的羊抗兔IgG，按上述步骤做第二重染色。 （11）TBS洗后，以缓冲甘油封盖，在荧光显微镜下分别以546nm及490nm波长的激发光观察TRITC及FITC所标示的X、Y抗原所在部位。 （12）如用彩色底片对切片同一部位用546nm及490nm波长的激发光分别做两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的两种抗原。 这种双标方法的关键在于完成第一重染色后，用多聚甲醛蒸气使二抗的游离抗原结合部位被固定而失活，不会再与下一重染色中的抗体系统发生交叉反应，因此也可称为分步固定法。多聚甲醛蒸气处理切片的时间，需根据切片的厚度掌握，一般5μm厚的切片，蒸气固定的时间需长达4h，效果较好。处理时间太短，可能使抗体灭活不彻底，仍然有可能与下一重染色中的一抗交叉反应。 同洗脱法一样，为检查甲醛蒸气固定对抗体的灭活效果，可以用正常兔血清以取代第二重染色中的一抗，按前述步骤做第二重染色，如果出现阳性，表明灭活不彻底，就需要再延长甲醛蒸气固定时间。 凡是经过甲醛溶液固定后仍然能保持抗原性的抗原，用这种分步固定法可以取得良好的双重或多重免疫染色结果，有些抗原对甲醛固定作用比较敏感，其抗原性可能被破坏，对这样的抗原可以在第一重染色中先行显示。 多聚甲醛蒸气对FITC和TRITC的颜色和强度几乎没有影响，但因FITC的荧光比较容易衰退，因此在第一重染色中先用TRITC标记的二抗，在第二重染色中再用FITC标记的二抗效果较好。 三、免疫酶标双标技术 免疫酶标双标技术与免疫荧光双标技术的原理有很多相同之处，但作为标记物的酶有好几种，如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GO）等，它们各自又有几种不同的底物，显色反应所得颜色也各不相同，因此，免疫酶染色的方法种类比免疫荧光染色更多样化。 酶反应物性质较稳定，不像标记在抗体上的荧光素那样容易被洗脱，在光镜下同一张切片可同时见到两种颜色的显色物并存，不必像两重荧光染色那样分别观察。 （一）洗脱法 原理步骤都与前述洗脱法双重免疫荧光染色相似，可按不同的酶和底物系统呈色，在完成第一重免疫酶染色后，将抗原抗体复合物洗脱，再做第二重染色。 用于双重酶染色的洗脱液有多种，常用的是pH2.2的甘氨酸-盐酸溶液，能够消除第一重染色的抗体系统与下一重染色的交叉反应，但保留显色反应所得的颜色。 （二）非洗脱法 1. 直接法 将两种不同的酶分别标记于两种特异性抗体上，用直接法染色，再分别由两种酶的底物呈色，即可得到双重染色结果。 如果采用同一种酶标记在不同的抗体上，则只能用顺序染色法。即先做第一重染色，用第一种底物与已定位的酶反应呈色，再进行第二重染色。在酶定位于第二种抗原后，用另一种底物显示不同的颜色。这往往需要一